Katedra i Zakład Chemii Medycznej

- 1 -

ĆWICZEIE 7: AALIZA ISTRUMETALA

Spektrofotometria absorpcyjna - kolorymetria

Instrumentalne metody analityczne oparte są na wykorzystaniu własności fizykochemicznych

substancji. Spektrofotometria absorpcyjna należy do metod optycznych opartych na

selektywnej absorpcji promieniowania świetlnego przez roztwór badanej substancji.

Tabela 1. Zakresy widma elektromagnetycznego

azwa

Zakres

Promieniowanie rentgenowskie

10

-2

– 10

2

A

Światło widzialne

400 – 750 nm

Podczerwień

0,75 – 1000 µm

Mikrofale

0,1 – 100 cm

Fale radiowe

1 – 1000 m

W zależności od wykorzystywanego zakresu widma rozróżniamy:

1. absorpcjometrię w nadfiolecie - spektrofotometria UV (ang. ultra violet) -

stosowana przy identyfikacji i oznaczaniu związków organicznych;

2. absorpcjometrię w świetle widzialnym - spektrofotometria Vis (ang. visible) -

zwana najczęściej kolorymetrią lub fotokolorymetrią;

3. absorpcjometrię w podczerwieni - spektrofotometria IR (ang. infra reel),

wykorzystywaną głównie do badań strukturalnych związków organicznych.

Kolorymetria stanowi jedną z podstawowych, powszechnie stosowanych, szybkich metod

oznaczania ilościowego badanych substancji w roztworze. Kolorymetrycznie można

oznaczać substancje barwne (barwa własna jonu danego pierwiastka lub barwa

związku).

Barwa

substancji

jest

wynikiem

absorpcji

lub

przepuszczania

promieniowania z zakresu widma widzialnego w sposób selektywny. Obserwowane

zabarwienie jest dopełnieniem barwy promieniowania absorbowanego.

Tab 2.

Absorbowane promieniowanie

Długość fali (nm)

Barwa

Zabarwienie obserwowane

380 - 420

fioletowa

zielonożółte

420 - 440

fioletowoniebieska

żółte

Katedra i Zakład Chemii Medycznej

- 2 -

440 - 470

niebieska

pomarańczowe

470 - 500

niebieskozielona

czerwone

500 - 520

zielona

purpurowe

520 - 550

żółtozielona

fioletowe

550 - 500

żółta

fioletowoniebieskie

580-620

pomarańczowa

niebieskie

620 - 600

czerwona

niebieskozielone

680 - 700

purpurowa

zielone

Podstawę spektrofotometrii absorpcyjnej stanowią prawa Bouguera - Lamberta i Beera. Jeżeli

na warstwę jakiegoś jednorodnego ciała (np. na warstwę roztworu substancji barwnej) pada

wiązka światła jednobarwnego o natężeniu (I

0

), to pewna część tego światła zostanie odbita

(I

r

), część ulegnie absorpcji (I

a

), a reszta zostanie przepuszczona (I

t

).

I

o

= I

r

+ I

a

+ I

t

W przypadku roztworów wodnych odbicie światła jest bardzo małe (nie przekracza kilku

procent) i dlatego można je pominąć. Wtedy:

I

o

= I

a

+ I

t

Pomiędzy natężeniem światła przepuszczonego (I

t

), grubością warstwy (l) i stężeniem tego

roztworu (c) istnieje zależność:

I

t

= I

0

• 10

-klc

lub

I

0

A = lg = k ·l · c

I

t

A - tzw. absorbancja

1

k - współczynnik absorbancji

l – grubość warstwy

c – stężenie roztworu

1

synonimy: ekstynkcja (E), gęstość optyczna

Katedra i Zakład Chemii Medycznej

- 3 -

Absorbancja (A):

- jest proporcjonalna do stężenia substancji absorbującej (c) oraz do grubości warstwy

roztworu (l) lub

- jest równa logarytmowi ilorazu natężenia promieniowania padającego (I

0

) i natężenia

promieniowania przepuszczonego (I

t

).

Współczynnik absorbancji k jest wielkością stałą zależną od długości fali światła

padającego, natury substancji rozpuszczonej i temperatury.

W przypadku gdy stężenie c jest wyrażone w mol/dm

3

nosi on nazwę molowego

współczynnika absorbancji (oznaczanego symbolem ε

2

). Wtedy:

I

0

A = lg = ε

ε

ε

ε ·l · c

I

t

ε- molowy współczynnik absorbancji

l - grubość warstwy (cm)

c - stężenie (mol/dm

3

)

Iloraz natężenia promieniowania przepuszczonego (I

t

) i natężenia promieniowania

padającego (I

0

) nosi nazwę transmitancji (T)

3

i wskazuje jaka część promieniowania zostaje

przepuszczona przez roztwór.

Zwykle wyraża się ją w procentach:

I

t

T = ·100

I

0

Między absorbancją (A) a transmitancją (T) występuje zależność:

1

A = lg = - lg T

T

Jeżeli dwa roztwory danej substancji o stężeniach c

1

i c

2

wykazują przy grubościach warstw l

1

i l

2

jednakowe natężenie barwy, to I

t1

= I

t2

. Wtedy:

2

w czułych metodach kolorymetrycznych wartość ε przekracza 10000; jeśli jest mniejszy

od 1000 - metoda jest mało czuła

3

synonimy: przepuszczalność, transmisja

Katedra i Zakład Chemii Medycznej

- 4 -

I

0

· 10

-kl1c1

= I

0

⋅⋅⋅⋅ 10

–kl2c2

l

1

c

1

= l

2

c

2

Oznacza to, że grubości warstw roztworów wykazujących jednakowe natężenie barwy są

odwrotnie proporcjonalne do stężeń tych roztworów. Wzór powyższy stanowi podstawę

wizualnej analizy kolorymetrycznej.

Ze względu na sposób wykonania pomiaru metody kolorymetryczne dzielimy na:

1. wizualne - bezpośrednie, wizualne porównywanie lub ocena intensywności barwy

roztworu badanego i roztworów wzorcowych. Są to metody subiektywne, oparte na

indywidualnej ocenie badającego, a tym samym zależne od właściwości jego wzroku,

zmęczenia wzroku itp.,

2. fotoelektryczne - pomiar absorbancji roztworu badanego i roztworów wzorcowych przy

użyciu detektorów promieniowania w postaci fotoogniwa lub fotokomórki. Pomiary takie

są obiektywne, niezależne od indywidualnych cech badającego.

Ze względu na sposób monochromatyzacji światła wyróżniamy dwa rodzaje aparatury

służącej do pomiarów fotoelektrycznych:

1. fotokolorymetry (kolorymetry fotoelektryczne) - wyposażone w filtry świetlne

umożliwiające tylko częściową monochromatyzację;

2. spektrofotometry - wyposażone w pryzmaty lub siatki dyfrakcyjne, dające światło ściśle

monochromatyczne.

Każdy aparat służący do oznaczeń absorpcjometrycznych zawiera następujące główne części

składowe:

1. źródło światła - jest nim lampa wodorowa dostarczająca promieniowanie z zakresu

nadfioletu, lub lampa wolframowa dająca promieniowanie z zakresu widzialnego oraz

bliskiej podczerwieni

2. urządzenie do monochromatyzacji światła - służące do otrzymania promieniowania o

ściśle określonej długości fali (promieniowania jednobarwnego) wyposażone w filtr

świetlny, pryzmat lub siatkę dyfrakcyjną

3. naczynka (kuwety) na roztwory - wykonane ze szkła laboratoryjnego (kolorymetria) lub

kwarcowe (spektrofotometria UV i IR)

Katedra i Zakład Chemii Medycznej

- 5 -

Każde oznaczenie fotoelektryczne wymaga ustalenia optymalnych warunków pomiaru dla

roztworu badanej substancji, tzn.:

- znalezienia długości fali (λ max), przy której ma miejsce największa absorbancja,

- dobrania takich stężeń roztworów, aby mierzone wartości absorbancji zawierały się w

granicach 0,1 - 0,8.

Podstawową metodą oznaczeń zarówno fotokolorymetrycznych jak i spektrofotometrycznych

jest metoda krzywej wzorcowej.

Przy użyciu roztworów wzorcowych

4

ustala się zależność absorbancji (A) od stężenia

oznaczanej substancji (c) i przedstawia ją na wykresie współrzędnych A/c. Jeżeli układ

stosuje się dokładnie do prawa Lamberta - Beera zależność ta stanowi linię prostą

5

.

Np. w oparciu o wyniki pomiarów (tabela 3) otrzymuje się krzywą wzorcową przedstawioną

na ryc. 1.

Tabela 3.

Nr próby

Stężenie roztworów

wzorcowych w mg/cm

3

Wartość absorbancji próby

(A)

1

0,1

0,10

2

0,3

0,28

3

0,5

0,45

4

0,7

0,60

5

0,9

0,81

4

roztwory o znanym, ściśle określonym stężeniu

5

stosowanie się układu do tego prawa nie jest warunkiem koniecznym; jeżeli krzywa jest

wykreślona w ściśle określony sposób, to może spełniać funkcję krzywej wzorcowej - stąd
metoda ta jest zalecana szczególnie do oznaczeń substancji, których roztwory wykazują
odchylenia od prawa Lamberta-Beera

Katedra i Zakład Chemii Medycznej

- 6 -

Ryc. 1

Następnie w identycznych warunkach mierzy się absorbancję badanego roztworu i z

uzyskanej wartości (A = 0,32) odczytuje stężenie oznaczonej substancji (c = 0,35 mg/cm

3

,

ryc.1).

Schemat układu optycznego przyrządu podstawowego przedstawia ryc.20.

Światło emitowane przez żarówkę (1) przechodzi przez kondensor (2) i po odbiciu od

zwierciadła (3) wchodzi do monochromatora przez szczelinę wejściową (4). Po przejściu

przez soczewkę (5) wiązka promieni pada na siatkę dyfrakcyjną (6), skąd po przejściu przez

soczewkę (7), trafia w postaci widma na szczelinę wyjściową (8). Za pomocą odpowiedniego

układu dźwigni, poruszanych bębnem (12) można obracać siatkę dyfrakcyjną i dzięki temu

przepuszczać przez szczelinę wiązki światła o różnych długościach fali. Promieniowanie

monochromatyczne po przejściu przez kuwetę (9) z roztworem badanym pada na filtr

wyrównawczy dla fotoelementu (10) i na fotoogniwo (11). Powstały w ogniwie prąd przez

Katedra i Zakład Chemii Medycznej

- 7 -

wzmacniacz tranzystorowy (13) dostaje się do potencjometru (14) wyskalowanego w

jednostkach absorbancji (A) lub transmitancji (T).

Część praktyczna

1. Kolorymetryczne oznaczanie stężenia jonów Cu

2+

(metoda krzywej wzorcowej).

Metoda oparta jest na pomiarze absorbancji ciemnoniebieskich roztworów kompleksu

[Cu(NH

3

)

4

]

2+

, który tworzą jony Cu

2+

z nadmiarem stężonego amoniaku NH

3

· H

2

O.

Warunki pomiaru:

-

długość fali: 585 nm

-

stężenia roztworów: 0,8 - 4,0 mg/cm

3

- grubość warstwy 1 cm

Wykonanie ćwiczenia

1. Roztwory wzorcowe:

a. do 5 czystych kolbek miarowych o pojemności 50 cm

3

odmierzamy po 5 cm

3

roztworów jonów Cu

2+

o stężeniach: 0,8; 1,6; 2,4; 3,2; 4,0 (mg/cm

3

).

b. do wszystkich kolbek dodajemy po 5 cm

3

stężonego NH

3

· H

2

O i uzupełniamy

wodą destylowaną do kreski.

c. otrzymane w ten sposób roztwory mają stężenia: 0,08; 0,16; 0,24; 0,32; 0,4.

2. Roztwór badany: do czystej kolbki miarowej o pojemności 50 cm

3

odmierzamy 5 cm

3

roztworu jonów Cu

2+

o nieznanym stężeniu, dodajemy 5 cm

3

stężonego NH

3

· H

2

O i

uzupełniamy wodą destylowaną do kreski.

3. Roztwór odnośny “odnośnik”: do czystej kolbki miarowej o pojemności 50 cm

3

odmierzamy 5 cm

3

stężonego NH

3

· H

2

O i uzupełniamy wodą destylowaną do kreski.

4. Pomiar absorbancji: - przygotowanie spektrokolorymetru "Specol" oraz sam pomiar

przeprowadzamy według instrukcji pod kontrolą prowadzącego ćwiczenia. Dokonujemy

pomiaru absorbancji roztworów przygotowanych w pkt. 1 i 2 wobec roztworu odnośnego

przygotowanego w pkt. 3.

5. Wykreślamy krzywą wzorcową i odczytujemy stężenie jonów Cu

2+

w roztworze

badanym.

UWAGA! H

3

⋅⋅⋅⋅ H

2

O odmierzamy cylindrem miarowym pod wyciągiem.

Katedra i Zakład Chemii Medycznej

- 8 -

Ćwiczenie 2

A.

Pomiar stężenie jonów Mg

2+

- metoda kolorymetryczna przy użyciu zestawu

diagnostycznego firmy Cormay.

Wykonanie:

Do 3 probówek odpipetować:

1 – próba zerowa: 2 cm

3

odczynnika 1-Mg + 20 µl H

2

O

2 – próba badana 2 cm

3

odczynnika 1-Mg

+ 20 µl materiału badanego (roztwór X

1,

X

2

lub

X

3

)

3 – próba wzorcowa 2 cm

3

odczynnika 1-Mg +20 µl standardu

Dokładnie wymieszać, inkubować 5 min. w temp. 37

0

C a następnie dokonać pomiaru absorbancji

próby wzorcowej A(PW) i próby badanej A(PB) wobec próby zerowej (PZ) przy długości fali 520 nm.

Stężenie glukozy (C

g

) obliczamy wg. wzoru:

A(PB)
C

g

= · C

wz

A(PW)
C

wz

– stężenie próby wzorcowej

Skład odczynników:

1-Mg: wodorotlenek potasu (pH=11,5), węglan potasowy, EGTA, błękit ksylidylowy, Triton X-100

standard: wzorcowy roztwór jonów magnezu: 0,82 mmmol/l (2,0 mg/dl).

B.

Pomiar stężenie jonów Ca

2+

- metoda kolorymetryczna przy użyciu zestawu

diagnostycznego firmy Cormay.

Wykonanie:

Do 3 probówek odpipetować:

1 – próba zerowa: 2 cm

3

odczynnika roboczego + 20 µl H

2

O

2 – próba badana 2 cm

3

odczynnika roboczego

+ 20 µl materiału badanego (roztwór X

1,

X

2

lub

X

3

)

3 – próba wzorcowa 2 cm

3

odczynnika roboczego

+20 µl standardu

Dokładnie wymieszać, inkubować 5 min. w temp. 37

0

C a następnie dokonać pomiaru absorbancji

próby wzorcowej A(PW) i próby badanej A(PB) wobec próby zerowej (PZ) przy długości fali

575 nm (570-580 nm).

Stężenie glukozy (C

g

) obliczamy wg. wzoru:

A(PB)
C

g

= · C

wz

A(PW)
C

wz

– stężenie próby wzorcowej

Katedra i Zakład Chemii Medycznej

- 9 -

Skład odczynników:

odczynnik roboczy: komplekson o-krezoloftaleina, 8-hydroksychinolina, kwas solny,

etanoloamina

standard – wzorcowy roztwór jonów wapnia - 2,5 nmol/l (10 mg/dl)/

Katedra i Zakład Chemii Medycznej

- 10 -