Katedra i Zakład Chemii Medycznej
- 1 -
ĆWICZEIE 7: AALIZA ISTRUMETALA
Spektrofotometria absorpcyjna - kolorymetria
Instrumentalne metody analityczne oparte są na wykorzystaniu własności fizykochemicznych
substancji. Spektrofotometria absorpcyjna należy do metod optycznych opartych na
selektywnej absorpcji promieniowania świetlnego przez roztwór badanej substancji.
Tabela 1. Zakresy widma elektromagnetycznego
azwa
Zakres
Promieniowanie rentgenowskie
10
-2
– 10
2
A
Światło widzialne
400 – 750 nm
Podczerwień
0,75 – 1000 µm
Mikrofale
0,1 – 100 cm
Fale radiowe
1 – 1000 m
W zależności od wykorzystywanego zakresu widma rozróżniamy:
1. absorpcjometrię w nadfiolecie - spektrofotometria UV (ang. ultra violet) -
stosowana przy identyfikacji i oznaczaniu związków organicznych;
2. absorpcjometrię w świetle widzialnym - spektrofotometria Vis (ang. visible) -
zwana najczęściej kolorymetrią lub fotokolorymetrią;
3. absorpcjometrię w podczerwieni - spektrofotometria IR (ang. infra reel),
wykorzystywaną głównie do badań strukturalnych związków organicznych.
Kolorymetria stanowi jedną z podstawowych, powszechnie stosowanych, szybkich metod
oznaczania ilościowego badanych substancji w roztworze. Kolorymetrycznie można
oznaczać substancje barwne (barwa własna jonu danego pierwiastka lub barwa
związku).
Barwa
substancji
jest
wynikiem
absorpcji
lub
przepuszczania
promieniowania z zakresu widma widzialnego w sposób selektywny. Obserwowane
zabarwienie jest dopełnieniem barwy promieniowania absorbowanego.
Tab 2.
Absorbowane promieniowanie
Długość fali (nm)
Barwa
Zabarwienie obserwowane
380 - 420
fioletowa
zielonożółte
420 - 440
fioletowoniebieska
żółte
Katedra i Zakład Chemii Medycznej
- 2 -
440 - 470
niebieska
pomarańczowe
470 - 500
niebieskozielona
czerwone
500 - 520
zielona
purpurowe
520 - 550
żółtozielona
fioletowe
550 - 500
żółta
fioletowoniebieskie
580-620
pomarańczowa
niebieskie
620 - 600
czerwona
niebieskozielone
680 - 700
purpurowa
zielone
Podstawę spektrofotometrii absorpcyjnej stanowią prawa Bouguera - Lamberta i Beera. Jeżeli
na warstwę jakiegoś jednorodnego ciała (np. na warstwę roztworu substancji barwnej) pada
wiązka światła jednobarwnego o natężeniu (I
0
), to pewna część tego światła zostanie odbita
(I
r
), część ulegnie absorpcji (I
a
), a reszta zostanie przepuszczona (I
t
).
I
o
= I
r
+ I
a
+ I
t
W przypadku roztworów wodnych odbicie światła jest bardzo małe (nie przekracza kilku
procent) i dlatego można je pominąć. Wtedy:
I
o
= I
a
+ I
t
Pomiędzy natężeniem światła przepuszczonego (I
t
), grubością warstwy (l) i stężeniem tego
roztworu (c) istnieje zależność:
I
t
= I
0
• 10
-klc
lub
I
0
A = lg = k ·l · c
I
t
A - tzw. absorbancja
1
k - współczynnik absorbancji
l – grubość warstwy
c – stężenie roztworu
1
synonimy: ekstynkcja (E), gęstość optyczna
Katedra i Zakład Chemii Medycznej
- 3 -
Absorbancja (A):
- jest proporcjonalna do stężenia substancji absorbującej (c) oraz do grubości warstwy
roztworu (l) lub
- jest równa logarytmowi ilorazu natężenia promieniowania padającego (I
0
) i natężenia
promieniowania przepuszczonego (I
t
).
Współczynnik absorbancji k jest wielkością stałą zależną od długości fali światła
padającego, natury substancji rozpuszczonej i temperatury.
W przypadku gdy stężenie c jest wyrażone w mol/dm
3
nosi on nazwę molowego
współczynnika absorbancji (oznaczanego symbolem ε
2
). Wtedy:
I
0
A = lg = ε
ε
ε
ε ·l · c
I
t
ε- molowy współczynnik absorbancji
l - grubość warstwy (cm)
c - stężenie (mol/dm
3
)
Iloraz natężenia promieniowania przepuszczonego (I
t
) i natężenia promieniowania
padającego (I
0
) nosi nazwę transmitancji (T)
3
i wskazuje jaka część promieniowania zostaje
przepuszczona przez roztwór.
Zwykle wyraża się ją w procentach:
I
t
T = ·100
I
0
Między absorbancją (A) a transmitancją (T) występuje zależność:
1
A = lg = - lg T
T
Jeżeli dwa roztwory danej substancji o stężeniach c
1
i c
2
wykazują przy grubościach warstw l
1
i l
2
jednakowe natężenie barwy, to I
t1
= I
t2
. Wtedy:
2
w czułych metodach kolorymetrycznych wartość ε przekracza 10000; jeśli jest mniejszy
od 1000 - metoda jest mało czuła
3
synonimy: przepuszczalność, transmisja
Katedra i Zakład Chemii Medycznej
- 4 -
I
0
· 10
-kl1c1
= I
0
⋅⋅⋅⋅ 10
–kl2c2
l
1
c
1
= l
2
c
2
Oznacza to, że grubości warstw roztworów wykazujących jednakowe natężenie barwy są
odwrotnie proporcjonalne do stężeń tych roztworów. Wzór powyższy stanowi podstawę
wizualnej analizy kolorymetrycznej.
Ze względu na sposób wykonania pomiaru metody kolorymetryczne dzielimy na:
1. wizualne - bezpośrednie, wizualne porównywanie lub ocena intensywności barwy
roztworu badanego i roztworów wzorcowych. Są to metody subiektywne, oparte na
indywidualnej ocenie badającego, a tym samym zależne od właściwości jego wzroku,
zmęczenia wzroku itp.,
2. fotoelektryczne - pomiar absorbancji roztworu badanego i roztworów wzorcowych przy
użyciu detektorów promieniowania w postaci fotoogniwa lub fotokomórki. Pomiary takie
są obiektywne, niezależne od indywidualnych cech badającego.
Ze względu na sposób monochromatyzacji światła wyróżniamy dwa rodzaje aparatury
służącej do pomiarów fotoelektrycznych:
1. fotokolorymetry (kolorymetry fotoelektryczne) - wyposażone w filtry świetlne
umożliwiające tylko częściową monochromatyzację;
2. spektrofotometry - wyposażone w pryzmaty lub siatki dyfrakcyjne, dające światło ściśle
monochromatyczne.
Każdy aparat służący do oznaczeń absorpcjometrycznych zawiera następujące główne części
składowe:
1. źródło światła - jest nim lampa wodorowa dostarczająca promieniowanie z zakresu
nadfioletu, lub lampa wolframowa dająca promieniowanie z zakresu widzialnego oraz
bliskiej podczerwieni
2. urządzenie do monochromatyzacji światła - służące do otrzymania promieniowania o
ściśle określonej długości fali (promieniowania jednobarwnego) wyposażone w filtr
świetlny, pryzmat lub siatkę dyfrakcyjną
3. naczynka (kuwety) na roztwory - wykonane ze szkła laboratoryjnego (kolorymetria) lub
kwarcowe (spektrofotometria UV i IR)
Katedra i Zakład Chemii Medycznej
- 5 -
Każde oznaczenie fotoelektryczne wymaga ustalenia optymalnych warunków pomiaru dla
roztworu badanej substancji, tzn.:
- znalezienia długości fali (λ max), przy której ma miejsce największa absorbancja,
- dobrania takich stężeń roztworów, aby mierzone wartości absorbancji zawierały się w
granicach 0,1 - 0,8.
Podstawową metodą oznaczeń zarówno fotokolorymetrycznych jak i spektrofotometrycznych
jest metoda krzywej wzorcowej.
Przy użyciu roztworów wzorcowych
4
ustala się zależność absorbancji (A) od stężenia
oznaczanej substancji (c) i przedstawia ją na wykresie współrzędnych A/c. Jeżeli układ
stosuje się dokładnie do prawa Lamberta - Beera zależność ta stanowi linię prostą
5
.
Np. w oparciu o wyniki pomiarów (tabela 3) otrzymuje się krzywą wzorcową przedstawioną
na ryc. 1.
Tabela 3.
Nr próby
Stężenie roztworów
wzorcowych w mg/cm
3
Wartość absorbancji próby
(A)
1
0,1
0,10
2
0,3
0,28
3
0,5
0,45
4
0,7
0,60
5
0,9
0,81
4
roztwory o znanym, ściśle określonym stężeniu
5
stosowanie się układu do tego prawa nie jest warunkiem koniecznym; jeżeli krzywa jest
wykreślona w ściśle określony sposób, to może spełniać funkcję krzywej wzorcowej - stąd
metoda ta jest zalecana szczególnie do oznaczeń substancji, których roztwory wykazują
odchylenia od prawa Lamberta-Beera
Katedra i Zakład Chemii Medycznej
- 6 -
Ryc. 1
Następnie w identycznych warunkach mierzy się absorbancję badanego roztworu i z
uzyskanej wartości (A = 0,32) odczytuje stężenie oznaczonej substancji (c = 0,35 mg/cm
3
,
ryc.1).
Schemat układu optycznego przyrządu podstawowego przedstawia ryc.20.
Światło emitowane przez żarówkę (1) przechodzi przez kondensor (2) i po odbiciu od
zwierciadła (3) wchodzi do monochromatora przez szczelinę wejściową (4). Po przejściu
przez soczewkę (5) wiązka promieni pada na siatkę dyfrakcyjną (6), skąd po przejściu przez
soczewkę (7), trafia w postaci widma na szczelinę wyjściową (8). Za pomocą odpowiedniego
układu dźwigni, poruszanych bębnem (12) można obracać siatkę dyfrakcyjną i dzięki temu
przepuszczać przez szczelinę wiązki światła o różnych długościach fali. Promieniowanie
monochromatyczne po przejściu przez kuwetę (9) z roztworem badanym pada na filtr
wyrównawczy dla fotoelementu (10) i na fotoogniwo (11). Powstały w ogniwie prąd przez
Katedra i Zakład Chemii Medycznej
- 7 -
wzmacniacz tranzystorowy (13) dostaje się do potencjometru (14) wyskalowanego w
jednostkach absorbancji (A) lub transmitancji (T).
Część praktyczna
1. Kolorymetryczne oznaczanie stężenia jonów Cu
2+
(metoda krzywej wzorcowej).
Metoda oparta jest na pomiarze absorbancji ciemnoniebieskich roztworów kompleksu
[Cu(NH
3
)
4
]
2+
, który tworzą jony Cu
2+
z nadmiarem stężonego amoniaku NH
3
· H
2
O.
Warunki pomiaru:
-
długość fali: 585 nm
-
stężenia roztworów: 0,8 - 4,0 mg/cm
3
- grubość warstwy 1 cm
Wykonanie ćwiczenia
1. Roztwory wzorcowe:
a. do 5 czystych kolbek miarowych o pojemności 50 cm
3
odmierzamy po 5 cm
3
roztworów jonów Cu
2+
o stężeniach: 0,8; 1,6; 2,4; 3,2; 4,0 (mg/cm
3
).
b. do wszystkich kolbek dodajemy po 5 cm
3
stężonego NH
3
· H
2
O i uzupełniamy
wodą destylowaną do kreski.
c. otrzymane w ten sposób roztwory mają stężenia: 0,08; 0,16; 0,24; 0,32; 0,4.
2. Roztwór badany: do czystej kolbki miarowej o pojemności 50 cm
3
odmierzamy 5 cm
3
roztworu jonów Cu
2+
o nieznanym stężeniu, dodajemy 5 cm
3
stężonego NH
3
· H
2
O i
uzupełniamy wodą destylowaną do kreski.
3. Roztwór odnośny “odnośnik”: do czystej kolbki miarowej o pojemności 50 cm
3
odmierzamy 5 cm
3
stężonego NH
3
· H
2
O i uzupełniamy wodą destylowaną do kreski.
4. Pomiar absorbancji: - przygotowanie spektrokolorymetru "Specol" oraz sam pomiar
przeprowadzamy według instrukcji pod kontrolą prowadzącego ćwiczenia. Dokonujemy
pomiaru absorbancji roztworów przygotowanych w pkt. 1 i 2 wobec roztworu odnośnego
przygotowanego w pkt. 3.
5. Wykreślamy krzywą wzorcową i odczytujemy stężenie jonów Cu
2+
w roztworze
badanym.
UWAGA! H
3
⋅⋅⋅⋅ H
2
O odmierzamy cylindrem miarowym pod wyciągiem.
Katedra i Zakład Chemii Medycznej
- 8 -
Ćwiczenie 2
A.
Pomiar stężenie jonów Mg
2+
- metoda kolorymetryczna przy użyciu zestawu
diagnostycznego firmy Cormay.
Wykonanie:
Do 3 probówek odpipetować:
1 – próba zerowa: 2 cm
3
odczynnika 1-Mg + 20 µl H
2
O
2 – próba badana 2 cm
3
odczynnika 1-Mg
+ 20 µl materiału badanego (roztwór X
1,
X
2
lub
X
3
)
3 – próba wzorcowa 2 cm
3
odczynnika 1-Mg +20 µl standardu
Dokładnie wymieszać, inkubować 5 min. w temp. 37
0
C a następnie dokonać pomiaru absorbancji
próby wzorcowej A(PW) i próby badanej A(PB) wobec próby zerowej (PZ) przy długości fali 520 nm.
Stężenie glukozy (C
g
) obliczamy wg. wzoru:
A(PB)
C
g
= · C
wz
A(PW)
C
wz
– stężenie próby wzorcowej
Skład odczynników:
1-Mg: wodorotlenek potasu (pH=11,5), węglan potasowy, EGTA, błękit ksylidylowy, Triton X-100
standard: wzorcowy roztwór jonów magnezu: 0,82 mmmol/l (2,0 mg/dl).
B.
Pomiar stężenie jonów Ca
2+
- metoda kolorymetryczna przy użyciu zestawu
diagnostycznego firmy Cormay.
Wykonanie:
Do 3 probówek odpipetować:
1 – próba zerowa: 2 cm
3
odczynnika roboczego + 20 µl H
2
O
2 – próba badana 2 cm
3
odczynnika roboczego
+ 20 µl materiału badanego (roztwór X
1,
X
2
lub
X
3
)
3 – próba wzorcowa 2 cm
3
odczynnika roboczego
+20 µl standardu
Dokładnie wymieszać, inkubować 5 min. w temp. 37
0
C a następnie dokonać pomiaru absorbancji
próby wzorcowej A(PW) i próby badanej A(PB) wobec próby zerowej (PZ) przy długości fali
575 nm (570-580 nm).
Stężenie glukozy (C
g
) obliczamy wg. wzoru:
A(PB)
C
g
= · C
wz
A(PW)
C
wz
– stężenie próby wzorcowej
Katedra i Zakład Chemii Medycznej
- 9 -
Skład odczynników:
odczynnik roboczy: komplekson o-krezoloftaleina, 8-hydroksychinolina, kwas solny,
etanoloamina
standard – wzorcowy roztwór jonów wapnia - 2,5 nmol/l (10 mg/dl)/
Katedra i Zakład Chemii Medycznej
- 10 -