2012-10-20

1

BADANIE PŁYNU

MÓZGOWO-RDZENIOWEGO

Analityka ogólna i techniki pobierania materiału

P

ŁYN MÓZGOWO RDZENIOWY

-

WIADOMOŚCI OGÓLNE



Jasna, klarowna cieć, wypełniająca przestrzeń podpajęczynówkową ,
chroniąc ośrodkowy układ nerwowy.



Powstaje głównie w splotach naczyniówki komór mózgu (głównie bocznych),
które stanowią tkankę bogato unaczynioną (70%)



PMR powstaje na drodze:

-

wybiórczej sekrecji składników osocza przez komórki nabłonkowe splotu;

(BARIERA KREW-MÓZG)

-

Przenikania komórek z krwi

-

Wydzielania składników przez komórki OUN.



Dobowa synteza PMR u dorosłego człowieka wynosi ok. 500 ml, ale
pojemność przestrzeni płynowych wynosi zaledwie 85-150 ml, co oznacza 3
krotną wymianę płynu w ciągu doby (u noworodków: 10-60 ml).

2012-10-20

2

F

UNKCJE

PMR



Ochronna dla mózgowia



Wydalnicza

Eliminacja zbędnych produktów przemiany materii

oraz substancji toksycznych



Transportowa

Transport substancji do miejsc docelowych OUN z

odległych miejsc syntezy

WSKAZANIA DO BADANIA

PMR

m.in.:



Zakaźne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowego



Aseptyczne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych



Ropień OUN



Krwawienie podpajęczynówkowe



Choroby demielinizacyjne



Polineuropatie zapalne



Przerzuty nowotworowe do opon mózgowych



Guzy mózgu



Toczeń układowy



Choroby otępienne (Alzheimera, Creutzfeldta-Jakoba)

2012-10-20

3

P

RZECIWWSKAZANIA DO POBRANIA

PMR



podwyższone ciśnienie śródczaszkowe



miejscowe zakażenie skóry w miejscu punkcji



sepsa



zaburzenia krzepliwości krwi

(ryzyko krwawienia po punkcji)



ciężka niewydolność krążeniowo-oddechowa u
noworodków

P

OBRANIE PŁYNU DO BADANIA

Miejsca pobrania:

-

punkcja lędźwiowa (L3-L4/ L4-L5)(najczęstsza)

-

punkcja podpotyliczna

(zmiany zapalne skóry okolicy lędźwiowej)

-

punkcja komór bocznych przez ciemiączko

(tylko u niemowląt)

* PMR pobiera lekarz!



U dorosłego człowieka pobiera się jednorazowo maks. do 9 ml
PMR, w kilku porcjach po 2-3 ml, do suchej próbówki; U dzieci
do 2 ml [Guder WG, 2009]



Jednocześnie z próbką PMR należy zawsze pobrać próbkę krwi
na skrzep, pozwalającą uzyskać ok. 2 ml surowicy!!!



Badanie płynu wymaga porównania oznaczanych parametrów
we krwi!



Różnica czasu może wynosić do 12 godz.



PMR i krew pobierać do próbówek polipropylenowych



Badanie w PMR i krwi należy wykonać w tym samym cyklu
pomiarowym, przez tego samego analityka.

2012-10-20

4

KOLEJNOŚĆ BADANIA PRÓBEK PMR

1.

Testy chemiczne i immunologiczne

2.

Badanie mikrobiologiczne

3.

Badanie cytologiczne

TRANSPORT PŁYNU



Płyn wraz z krwią pacjenta należy dostarczyć do laboratorium
w możliwie jak najkrótszym czasie od pobrania

(autoliza elementów morfotycznych – po kilkunastu minutach)



Badanie powinno być wykonane do 30-45 min (maks. do 2
godz.) od pobrania

(CIT0)



Do badań mikrobiologicznych (podłoże transportowe, 37°C)



W przypadku oznaczeń białka płyn może być przechowywaniu
w temp. pokojowej do 2-3 dni lub w temp. 4°C do 2 miesięcy.



Istnieje możliwość zamrożenia płynu w – 20°C nawet do kilku
lat, w objętości powyżej 0,5 ml.

Nie dopuszcza się wielokrotnego zamrażania i rozmrażania

PMR!

2012-10-20

5

B

ADANIE

PMR

Próbkę delikatnie wymieszać

Badanie cytologiczne

(cytoza metodą komorową + rozmaz)

Badanie właściwości fizycznych (przed i po wirowaniu 1500 rpm, 10min)

• barwa

• przejrzystość

Badanie właściwości chemicznych (płyn odwirowany):

RUTYNOWO: DODATKOWO:

* białko (próby białkowe + oznaczenie ilościowe) * chlorki (jony)

* glukoza * albumina

* mleczany * IgG

T

RZY

PROGRAMY BADANIA

PMR

(

WG

.

REIBER I PETER

, 2001)

2012-10-20

6

W

YGLĄD

PMR



Prawidłowy PMR jest cieczą bezbarwną i klarowną, pH= 7,3-7,4



Informacja o zmianie wyglądu płynu powinna być umieszczona na skierowaniu do
laboratorium!!!

Badanie:

Oceny klarowności należy dokonać w przeźroczystej próbówce, na ciemnym tle.

Oceny barwy- w świetle dziennym, na białym tle.

PŁYN KRWISTY:

- krwawienie podpajeczynówkowe lub sródmózgowe

- „krwawienie sztuczne” (uszkodzenie naczyń żylnych podczas punkcji)

Różnicowanie I:

w przypadku krwawienia wywołanego podczas nakłucia lędźwiowego, płyn

pobierany do kolejnych 3 próbówek ulega stopniowemu przejaśnieniu w każdej kolejnej próbówce.

Płyn w krwawieniu podpajęczynówkowym jest jednolicie krwisty w każdej próbówce.

Ważne!!!: obserwować wygląd płynu podczas pobrania. Informacja powinna być umieszczona na

skierowaniu do laboratorium.

Różnicowanie II

:

płyn skrwawiony odwirować. Jeśli po wirowaniu płyn jest klarowny,

bezbarwny i wykazuje ujemną próbę benzydynową, można wnioskować, iż krew pochodziła z

nakłucia.

W

YGLĄD

PMR



PŁYN KSANTOCHROMICZNY

(żółty, pomarańczowy, różowy)



przebyte krwawienie podpajeczynówkowe lub sródmózgowe (

rozpad Hb)



żółtaczki ze stężeniem bilirubiny w surowicy w granicach 10-15 mg/dl



oksyhemoglobina



stężenie białka w płynie powyżej 150 mg/dl



karoten



PŁYN MĘTNY

[0 (przejrzysty) do +4 (bardzo mętny)]



zwiększenie liczby komórek krwi (leukocyty > 200/µl i erytrocyty > 400/µl)- widoczne
zmętnienie



obecność bakterii (opalescencja)



wysokie stężenie białka

-

Różnicowane

: jeśli po odwirowaniu PMR zmętnienie zanikło, oznacza, iż pochodziło od wysokiej pleocytozy.

Zmętnienie od bakterii i/lub białka nie zanika po odwirowaniu.



PŁYN ULEGAJĄCY WYKRZEPIANIU



Aktywacja czynników krzepnięcia w PMR na skutek wolniejszego przepływu płynu
(zespół Froina- blok kanału kręgowego)

•

płyn skrwawiony lub mętny należy odwirować i umieścić informację o jego wyglądzie
również po odwirowaniu.

2012-10-20

7

C

YTODIAGNOSTYKA

PMR-

OCENA PLEOCYTOZY



PLEOCYTOZA- liczba komórek jądrzastych powyżej 5/1µl płynu



Cytoza prawidłowa: < 5/µl u dorosłych, < 30/µl u noworodków

Prawidłowy układ odsetkowy w PMR:

Komórki

DOROŚLI

NOWORODKI

Limfocyty
Monocyty
Neutrofile

40-80%

15-45%

0-6%

5-35%

50-90%

0-8%

C

YTODIAGNOSTYKA

PMR-

OCENA PLEOCYTOZY

Ocena pleocytozy



komora Fuscha-Rosentala (3,2 µl), Neubauera lub inna



Płyn bezbarwny klarowny nie wymaga rozcieńczania; w przypadku zmętnienia lub
wysokiej pleocytozy należy płyn rozcieńczyć odpowiednio od 1:10 nawet do 1:10 000
solą fizjologiczną;



W celu lepszej wizualizacji, płyny wymagające rozcieńczenia można podbarwić odcz.
Samsona

lub Türka (100 µl PMR i 10 µl płynu) (5-30 min) (liza erytrocytów,

zabarwienie jąder pleocytów)



Ocena liczby komórek na całej siatce (16 mm

2

) podzielona przez 3 (liczba komórek/ µl)



Podajemy liczbę komórek/µl lub w L

2012-10-20

8

C

YTODIAGNOSTYKA

PMR-

OCENA PLEOCYTOZY

-

Należy zwrócić uwagę na występowanie erytrocytów (przed barwieniem).

-

Opisać ich ilość jako (pojedyncze, nieliczne, dość liczne, liczne,
świeże/wyługowane) lub policzyć na komorze Bürkera (kom/µl).

•

w PMR znacznie zanieczyszczonym krwią zaleca się ocenę liczby leukocytów
i erytrocytów na analizatorze hematologicznym (zaznaczyć na wyniku)!

•

Ze względu na utrudnione odróżnienie erytrocytów (obkurczonych) od
niebarwionych leukocytów, można korzystać z różnicy pomiędzy liczbą
całkowitą komórek w PMR a liczba wybarwionych leukocytów.

L

ICZENIE W ZALEŻNOŚCI OD PLEOCYTOZY



Pleocytoza niska (5-10/µl):

-

liczenie na całej siatce (16 mm

2

)/3



Pleocytoza średnia (10-25/µl):

-

Liczba komórek na 5 kwadratach (5 mm

2

)



Pleocytoza wysoka (> 50/ /µl):

-

Liczba komórek na 1 kwadracie (1 mm

2

) x 5

2012-10-20

9

PREPARATY CYTOLOGICZNE

(

CYTOGRAMY

)

Jeśli pleocytoza jest nieprawidłowa, należy bezwzględnie wykonać

preparat cytologiczny!



Przed wykonaniem preparatu cytologiczneg PMR należy go zagęścić



Zagęszczanie poprzez wirowanie w „zwykłej” wirówce prowadzi do
zniszczenia komórek, głównie monocytów i makrofagów

Metody zagęszczania PMR:

1.

Wirowanie w zwyklej wirówce (zniszczenie elementów morfotycznych, niski odzysk)
NIEZALECANE!!!

2.

Metoda swobodnej sedymentacji na szkiełku (mały odzysk)

3.

Sączenie płynu przez błony półprzepuszczalne (kosztowne, czasochłonne)

4.

Cytowirowanie (najczęściej stosowane)

WYKONANIE PREPARATU

-

CYTOSPIN

Do przygotowania cytospinu potrzebne są:

-

cytowirówka lub specjalny rotor do cytospinów

-

podstawka na preparat (saneczki)

-

szkiełko podstawowe

-

bibuła

-

nakładka

-

odpowiednia objętość płynu

-

1000-1500 rpm /8 -10 min

Objętość PMR do przygotowania preparatu:



cytoza < 500/µl: 200 µl płynu



cytoza 500-1000/µl: 100 µl płynu



cytoza > 1000/µl: płyn rozcieńczyć solą fizjologiczną do 1000/µl i nanieść
100 µl

Należy wykonać co najmniej 2 preparaty PMR!

2012-10-20

10

Po wyciągnięciu preparatu z cytowirówki, należy zdjąć bibułę i
wysuszyć preparat w temp. pok. przez co najmniej 60 min.
Po wyschnięciu preparat zabarwić MGG lub metodą Wrighta.



Barwienie metodą MGG

-

Po wyschnięciu i/lub utrwaleniu preparatów należy je wybarwić wg.
procedury:

1)

Odczynnik May-Grünwalda (alkoholowy r-ór eozyny i błękitu
metylenowego)– 3 min

2)

Woda destylowana- 2 min

3)

Odczynnik Giemsy- 8 min

(10% r-r Giemsy)

4)

Płukanie woda bieżącą

5)

Suszenie w temp. pokojowej, pod kątem 45°

Oglądać preparat pod imersją (powiększenie 1000x) na całej
powierzchni preparatu (przy niskich cytozach) lub do 200 kolejnych
krwinek białych. Podać wartość odsetkową.

PREPARATY CYTOLOGICZNE

O

CENA ODSETKOWA



Granulocyty (obojętnochłonne i kwasochłonne)



Komórki limfoidalne



Komórki limfocytowe



Komórki monocytowe



Makrofagi



Fibrocyty



Komórki wyściółki opon



Komórki splotu naczyniówkowego



Komórki atypowe

2012-10-20

11

E

LEMENTY MORFORTYCZNE

PMR

GRUPA LIMFOCYTOWO-PLAZMOCYTOWA

Limfocyty (T)

-

Komórki małe, jednojądrzaste, z okrągłym, silnie barwiącym się jądrem i
wąskim pasmem cytoplazmy.

-

Limfocyty małe występują w prawidłowym PMR i stanowią 40-80%
komórek jądrzastych w PMR

Limfocyty (B i Null)

-

Komórki średnie i duże, z okrągłym, silnie barwiącym jądrem, błękitną
cytoplazmą. Limfocyty „aktywowane” mają większą obwódkę silnie
niebieskiej cytoplazmy często z wypustkami, jądro z gruboziarnistą
chromatyną, widoczne jąderka, przejaśnienie wokół jądra.

Plazmocyt

-

Małe i średnie kom. jednojądrzaste, podobne do małych limfocytów, jądro

ułożone mimośrodkowo, obfita i ciemnoniebieska cytoplazma z
przejaśnieniem wokół jądra. Chromatyna jądrowa wykazuje
szprychowate ułożenie



GRUPA LIMFOCYTOWO-PLAZMOCYTOWA

LIMFOCYTY

KOMÓRKI PLAZMATYCZNE

Infekcyjne zapalenie OMR
-Wirusowe
-Grzybicze
-Gruźlicze
-Kiłowe
- Późna faza zakażenia bakteryjnego
 Choroby demielinizacyjne
 Naużywanie narkotyków

 Gruźlicze i kiłowe zapalenie OMR (obok

limfocytozy)

 Choroby demielinizacyjne

2012-10-20

12

E

LEMENTY MORFOTYCZNE

PMR



GRUPA MONOCYTOWA-MAKROFAGOWA

(monocyty, monocyty aktywowane, makrofagi)

-

Mało trwałe w warunkach ex vivo, autoliza

-

Komórki fagocytujące (

kompleksy immunologiczne, obumarłe komórki, zdenaturowane

białka)

Monocyty

-

kom. jednojądrzaste, zróżnicowany kształt jądra, często nerkowaty,
niebieskawa cytoplazma. Liczne wodniczki w cytoplazmie w czasie
pobudzenia komórki

Makrofagi

-

kom. o nieregularnych konturach, szaroniebieska cytoplazma,

wakuole w cytoplazmie. Jedno lub dwa jądra



Erytrocytofagi (makrofagi ze sfagocytowanymi erytrocytami, zawierające
kryształy pośrednich przemian Hb, np., hemosyderyny, bilirubiny,
hematoidyny)

-

występują w stanach patologii (krwawienie do przestrzeni płynowych)

E

LEMENTY MORFOTYCZNE

PMR

MONOCYTY/MAKROFAGI

ERYTROFAGI

 Gruźlicze zapalenie OMR
 Grzybicze zapalenie OMR
 Fagocytoza w następstwie obecności:
- erytrocytów
- lipidów
- bilirubiny
- stłuczenia mózgu
- zniszczenia komórek
 Środki cieniujące

 Krwawienie do przestrzeni płynowych

2012-10-20

13

I

NNE KOMÓRKI

Granulocyty obojętnochłonne

Erytrocyty

Blasty
(młode formy
komórkowe)

 Infekcyjne zapalenie OMR (faza wczesna)
-Bakteryjne (zwykle 90%)
-Wirusowe
-Grzybicze
-Gruźlicze
-Amebowe
 Ropień mózgu
 Krwawienie podpajęczynówkowe/ sródmózgowe
 Podaż środków kontrastowych

Krwawienie do przestrzeni
płynowych lub punkcja
lędźwiowa

-komórki białaczkowe”
-Polimorfizm jądra i
cytoplazmy

L

IMFOCYTY I PLAZMOCYTY

Ryc. Limfocyty małe, średnie i duże w PMR Ryc. Odczyn limfocytowo-plazmocytowy

w przebiegu wirusowego zapalenie OMR

2012-10-20

14

O

DCZYN LIMFOCYTOWY

Ryc. PMR z domieszką erytrocytów. Ryc. Odczyn limfocytowo-makrofagowy.

Odczyn limfocytowy, makrofag. Limfocyty, monocyty reaktywne

M

ONOCYTY I MAKROFAGI

Ryc. Makrofag, limfocyt i dwa monocyty. Ryc. Prolimfocyty, limfocyty aktywowane

Wakuolizacja cytoplazmy

2012-10-20

15

O

DCZYNY KOMÓRKOWE

Ryc. Odczyn limfocytowo-plazmocytowy. Ryc. Odczyn granulocytowy w zapaleniu

Erytrocyty o zmienionej morfologii o etiologii bakteryjnej. Granulocyty

zalegające PMR obojetnochlonne

E

LEMENTY MORFOTYCZNE

Ryc. Makrofagi ze złogami hemosyderyny Ryc. Makrofag z żółtymi kryształami

i kryształami bilirubiny, otoczone erytrocytami bilirubiny i złogami ciemnobrunatnej

hemosyderyny.

Późne stadium po krwotoku

2012-10-20

16

LITERATURA

1.

Mantur M, Lewczuk P. Płyn mózgowo-rdzeniowy. Badanie i
interpretacja wyników. Wydawnictwo Ekonomia i Środowisko,
Białystok, 2002.

2.

Dembinska-Kieć A, Naskalski JW. Diagnostyka laboratoryjna z
elementami biochemii klinicznej. Urban & Partner, Wrocław, 2010.

3.

Uszyński M (red.). Płyny z jam ciała. Powstawanie i badania
laboratoryjne. PZWL, Warszawa, 1998.

4.

Guder WG i wsp. Próbki: od pacjenta do laboratorium. MedPharm
Polska, Wrocław, 2009.

5.

Angielski S (red.). Biochemia kliniczna i analityka. PZWL, Warszawa,
1980.

6.

Brunzel NA. Diagnostyka laboratoryjna. Płyn mózgowo-rdzeniowy i
inne płyny ustrojowe. Kemona H, Mantur M (red.). Elsevier U&P,
Wroclaw, 2010.