Medycyna Wet. 2008, 64 (2)

223

Praca oryginalna

Original paper

Plazma nasienia jest kompleksem bia³ek, których

synteza zwi¹zana jest z j¹drami, naj¹drzami i dodat-

kowymi gruczo³ami p³ciowymi (14). W sk³adzie bio-

chemicznym bia³ek plazmowych zidentyfikowano en-

zymy, hormony (12), inhibitory proteinaz, glikoprote-

iny (15). Op³aszczaj¹c siê po ejakulacji na powierzch-

ni plazmolemy w obrêbie struktur biochemicznych

plemników, bia³ka staj¹ siê systemami polifunkcyjny-

mi warunkuj¹cymi zdolnoœæ zap³adniaj¹c¹ plemników,

decyduj¹cymi czêsto o p³odnoœci samca (17). W ostat-

nim okresie uzyskano interesuj¹ce rezultaty badañ

wskazuj¹ce, ¿e niektóre bia³ka plazmowe determino-

waæ mog¹ p³odnoœæ buhajów (7), ogierów (1) i knu-

rów (4). Podkreœlono ich wp³yw na przydatnoœæ na-

sienia do kriokonserwacji (5). Niemniej za niezbêdne

nale¿y uznaæ dalsze poszukiwania nowych rozwi¹zañ

metodycznych pozwalaj¹cych na charakterystykê

strukturaln¹ bia³ek plazmy nasienia zwi¹zanych z p³od-

noœci¹.

Obok rutynowo stosowanych w laboratoriach bio-

chemicznych metod chromatografii powinowactwa,

chromatografii odwróconej fazy HPLC, sekwencjono-

wania bia³ek, szczególne zainteresowanie dotyczy

wysokorozdzielczych metod elektroforezy. Dwukie-

runkowa elektroforeza w ¿elu poliakryloamidowym

(2-D PAGE), obok spektrometrii masowej (MS), na-

le¿y do bloku analitycznego stosowanego w proteo-

mice, umo¿liwiaj¹c, miêdzy innymi, mapowanie bia-

³ek (11). Termin mapowanie bia³ek (protein mapping)

dotyczy identyfikacji pojedynczych polipeptydów

w z³o¿onych mieszaninach bia³ek przy wykorzystaniu

metody 2-D. Omawiana metoda stanowi po³¹czenie

izoelektroogniskowania (IEF) i elektroforezy w ¿elu

poliakryloamidowym w obecnoœci soli sodowej siar-

czanu dodecylosodowego (SDS-PAGE) (10). W ten

sposób metoda 2-D pozwala na jednoczesn¹ identyfi-

kacjê bia³ek na podstawie ich ³adunku elektrostatycz-

nego oraz masy cz¹steczkowej. Dwukierunkowa elek-

troforeza w ¿elu poliakryloamidowym zosta³a wyko-

rzystana do charakterystyki plazmy nasienia ró¿nych

gatunków ssaków (1-3, 7, 9).

Celem badañ by³a ocena zmiennoœci liczby polipep-

tydów w plazmie nasienia, identyfikowanych metod¹

elektroforezy dwukierunkowej, w zale¿noœci od wie-

ku knurów i sezonu, w którym pozyskiwano nasienie.

Mapowanie bia³ek plazmy nasienia knura

przy wykorzystaniu metody elektroforezy

dwukierunkowej w ¿elu poliakryloamidowym*

)

W£ADYS£AW KORDAN, JERZY STRZE¯EK, DANIEL SOLIWODA,

MAREK LECEWICZ, MARZENA MOGIELNICKA

Katedra Biochemii i Biotechnologii Zwierz¹t Wydzia³u Bioin¿ynierii Zwierz¹t UWM, ul. Oczapowskiego 5, 10-718 Olsztyn

Kordan W., Strze¿ek J., Soliwoda D., Lecewicz M., Mogielnicka M.

Mapping of boar seminal plasma proteins by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis

Summary

An attempt was made to use a modified 2-D PAGE technique to analyze seminal plasma proteins and their

polymorphisms in relation to boar age and season. The 2-D PAGE analysis of seminal plasma proteins

was performed using a buffer pH gradient of 3 to 10. Modifications to the 2-D PAGE procedure included

substituting mercaptoethanol (ME) with dithiothreitol (DTT) and the use of a specific reagent assay (Plus One

2-D Clean-Up Kit, Amersham Biosciences), which markedly improved the resolution of the electrophoregrams.

Polymorphisms by polypeptide mapping of boar seminal plasma were dependent on the animal age and

season. Furthermore, the amount of polypeptides detected in the seminal plasma was significantly lower in 12

month-old boars compared with 3 year-olds. Additionally, the seminal plasma polypeptides were markedly

lower in the summer than in the autumn. The results of the study showed that mapping seminal plasma

proteins may be used as a marker for the secretor activity of boar accessory sex glands, and as a selection

criterion for male reproduction.

Keywords: boar, seminal plasma, polyacrylamide gel electrophoresis

*

)

Badania wykonane w ramach tematu badañ statutowych UWM w Olszty-

nie nr 0103.0803.

Medycyna Wet. 2008, 64 (2)

224

Materia³ i metody

Materia³ doœwiadczalny. Ejakulaty pobierano metod¹

manualn¹ od trzech knurów rasy wbp i pbz stacjonuj¹cych

w Laboratorium Biologii Rozrodu Katedry Biochemii

i Biotechnologii Zwierz¹t UWM w Olsztynie. Analizie

poddano 24 ejakulaty. Uzyskano zgodê Lokalnej Komisji

Etycznej w Olsztynie na pobieranie nasienia.

Przygotowanie próbek plazmy nasienia do rozdzia-

³ów elektroforetycznych metod¹ 2-D PAGE. Do badañ

stosowano plazmê nasienia uzyskan¹ po dwukrotnym wi-

rowaniu nasienia przez 20 minut, odpowiednio, przy 900 × g

i 10 000 × g, w temperaturze pokojowej. Przed wykona-

niem rozdzia³u elektroforetycznego w próbach oznaczano

zawartoœæ bia³ka (18). Zastosowano oryginaln¹, zmodyfi-

kowan¹, procedurê przygotowania prób plazmy nasienia

do rozdzia³ów elektroforetycznych. Próby rozcieñczano do

koñcowej koncentracji 0,1 mg bia³ka/ml i preinkubowano

w obecnoœci specyficznego zestawu odczynnikowego (Plus

One 2-D Clean-Up Kit, Amersham Biosciences) zgodnie

z procedur¹ podan¹ przez producenta. Po preinkubacji próby

zawieszano w 100 µl zmodyfikowanego buforu lizuj¹cego

(9,5 M mocznik – Amersham Biosciences, 2% Triton

X-100 – Sigma, 65 mM (0,65 × 10

–1

M) DTT – Serva, 2%

roztwór amfolitów w zakresie pH 3-10 – Amersham Bio-

sciences) i poddawano elektroforezie dwukierunkowej.

Elektroforeza dwukierunkowa (2-D PAGE) bia³ek

plazmy nasienia. Przeprowadzono j¹ zgodnie z metod¹ po-

dan¹ przez O’Farrel i wsp. (10), w gradiencie pH 3-10.

Izoelektroogniskowanie (IEF). ¯ele do izoelektroognis-

kowania (9,2 M mocznik, 4% poliakryloamid – Sigma, 20%

Triton X-100, 2% roztwór amfolitów w zakresie pH 3-10)

poddawano wstêpnej preelektroforezie z zastosowaniem

zmiennych wartoœci napiêcia (200 V – 10 min., 300 V –

15 min., 400 V – 15 min.). Zasadniczy rozdzia³ elektrofo-

retyczny, poprzedzony elektoforez¹ wstêpn¹ (500 V –

10 min.) prowadzono w temperaturze pokojowej (850 V –

4,5 godziny).

Elektroforeza denaturuj¹ca (SDS-PAGE). Po izoelek-

troogniskowaniu, ¿ele poddawano inkubacji w buforze

ekwilibruj¹cym (0,0625 M Tris-HCl, pH 6,8; 2,3% SDS,

5,0% 2-merkaptoetanol – Serva, 10% glicerol – POCH,

Gliwice, 0,05% b³êkit bromofenolowy, metanol – POCH,

Gliwice) przez 10 minut. Rozdzia³y elektroforetyczne pro-

wadzono w 15% ¿elu poliakryloamidowym w obecnoœci

(SDS) oraz przy zastosowaniu buforu Tris-glicyna-SDS (pH

8,3) (8), wykorzystuj¹c aparat Mini Protean II (Bio-Rad).

Detekcja próbek po elektroforezie 2-D PAGE. ¯ele

poliakryloamidowe barwiono metod¹ srebrow¹ z wykorzy-

staniem zestawu odczynników Silver staining kit (Amer-

sham Biosciences) (6). Analizê elektroforegramów prze-

prowadzono z zastosowaniem programu komputerowego

PD Quest

TM

(Bio-Rad). Program ten pozwala na jednoczes-

ne i precyzyjne wyznaczenie masy cz¹steczkowej oraz ³a-

dunków elektrostatycznych analizowanych bia³ek.

Wp³yw wieku i pory roku na profil elektroforetycz-

ny polipeptydów plazmy nasienia knura. Próbki plazmy

nasienia stosowane w badaniach elektroforetycznych

uzyskiwano z ejakulatów 3 knurów spe³niaj¹cych kryteria

normospermii, w odniesieniu do wybranych wskaŸników

makroskopowych, mikroskopowych, morfologicznych oraz

zawartoœci bia³ka ca³kowitego (tab. 1). Po pobraniu ejaku-

laty s¹czono przez steryln¹ gazê w celu usuniêcia frakcji

galaretowatej, a nastêpnie poddawano wirowaniu przy

10 000 × g w ci¹gu 15 minut, w temperaturze pokojowej.

Uzyskan¹ w ten sposób plazmê nasienia przechowywano

w temperaturze –80°C (193,2 K) do czasu dalszych analiz.

Uwzglêdniono 12-miesiêczne przedzia³y wiekowe knurów.

Badaniami profili elektroforetycznych objêto plazmy na-

sienia uzyskane od knurów w wieku: 12 miesiêcy, 24 mie-

siêcy, 36 miesiêcy i dodatkowo 42 miesiêcy. Uwzglêdnia-

j¹c zmiany d³ugoœci dnia œwietlnego oraz wp³yw tego zja-

wiska na w³aœciwoœci biologiczne nasienia wyodrêbniono

cztery okresy, w których wykonano badania profili elek-

troforetycznych, tj. wiosenny (obejmuj¹cy miesi¹ce: kwie-

cieñ, maj, czerwiec), letni (obejmuj¹cy miesi¹ce: lipiec,

sierpieñ, wrzesieñ), jesienny (obejmuj¹cy miesi¹ce: paŸ-

dziernik., listopad, grudzieñ) oraz zimowy (obejmuj¹cy

miesi¹ce: styczeñ, luty, marzec).

Analizê statystyczn¹ przeprowadzono przy pomocy pro-

gramu komputerowego Statistica 6.0 (statsoft). Stosowano

test Dunnetta.

Wyniki i omówienie

Bia³ka plazmy nasienia knura wykazuj¹ tendencjê

do agregacji powodowanej, miêdzy innymi, ich gliko-

proteinowym charakterem (15), co w znacznym stop-

niu utrudnia ich analizê elektroforetyczn¹. Stosowa-

nie klasycznej metody elektroforezy dwukierunkowej

(2-D) do analizy omawianych substancji nie daje za-

dowalaj¹cych rezultatów, co przejawia siê nisk¹ roz-

dzielczoœci¹ otrzymanych ektroforegramów i w koñ-

cowym efekcie nie pozwala na ich obiektywn¹ analizê.

W niniejszych badaniach podjêto próbê adaptacji me-

tody (2-D) do analizy bia³ek plazmy nasienia knura.

W wyniku modyfikacji metody 2-D PAGE, polega-

j¹cej na zastosowaniu specyficznego zestawu odczyn-

nikowego (Plus One 2-D Clean-Up) do preinkubacji

prób, otrzymano wzrost rozdzielczoœci elektroforegra-

mów. Zastosowanie preinkubacji w znacznym stop-

niu redukowa³o ingerencjê substancji niepo¿¹danych,

takich jak: kwasy nukleinowe, detergenty, sole, lipidy,

fenole. Dodatkowo zast¹pienie w buforze lizuj¹cym

2-merkaptoetanolu DTT (ditiotreitolem), posiadaj¹cym

wiêksz¹ zdolnoœæ redukcji mostków disiarczkowych

ze wzglêdu na obecnoœæ w sk³adzie dwóch grup tiolo-

wych (-SH), wp³ywa³o pozytywnie na rozdzielczoœæ

elektroforetyczn¹ bia³ek plazmy nasienia knura. Ob-

a

k

s

W

Ÿ k

i

n

x

a

i

m

r

e

p

s

o

m

r

o

N

)

6

1

(

g

w

m

c

(

u

t

a

l

u

k

a

j

e

æ

œ

o

t

e

j

b

O

3

)

8

7

,

8

4

2

0

0

4

-

0

0

1

0

1

(

w

ó

k

i

n

m

e

l

p

a

j

c

a

rt

n

e

c

n

o

K

6

m

c

/

3

)

4

4

,

0

8

5

0

0

6

-

0

5

1

)

%

(

w

ó

k

i

n

m

e

l

p

æ

œ

o

w

il

h

c

u

R

7

1

,

8

6

0

5

>

h

c

y

n

o

i

n

e

i

m

z

w

ó

k

i

n

m

e

l

p

k

e

t

e

s

d

O

)

%

(

e

i

n

z

c

i

g

o

l

o

fr

o

m

0

8

,

7

0

2

<

m

c

/

g

m

(

e

ti

w

o

k

³

a

c

o

k

³

a

i

B

3

)

3

3

,

6

3

0

0

,

8

3

o

³

o

k

o

Tab. 1. Wybrane wskaŸniki ejakulatów (n = 24)

Medycyna Wet. 2008, 64 (2)

225

serwowane zjawisko pozwoli³o na zastosowanie me-

tody 2-D do analizy map polipeptydowych plazmy

nasienia z uwzglêdnieniem wieku knurów i pory roku.

W obrêbie analizowanych elektroforegramów wyod-

rêbniono trzy grupy polipeptydów, przyjmuj¹c za kry-

terium podzia³u ich masê cz¹steczkow¹, tj.: £ 20,1

kDa – grupa I; 20,1-40 kDa – grupa II; 40-90 kDa –

grupa III.

Jak wynika z danych przedstawionych na ryc. 1, wraz

z up³ywem wieku knura obserwowano zmiany iloœcio-

we i jakoœciowe w sk³adzie map polipeptydowych.

Zjawisko to przejawia³o siê szczególnie wzrostem

ogólnej liczby polipeptydów u analizowanego osob-

nika, odpowiednio, od 52 w wieku 12

miesiêcy do 131 w wieku 36 miesiê-

cy. Dynamiczny wzrost liczby poli-

peptydów obserwowano szczególnie

w przedziale 20-40 kDa, od 16 u knu-

ra w wieku 1 roku do 53 u osobnika

w wieku 3 lat oraz w grupie polipep-

tydów o masie cz¹steczkowej 40-90

kDa, od 24 w wieku 12 miesiêcy do

49 w wieku 36 miesiêcy. Zmianom

iloœciowym frakcji polipeptydowych

towarzyszy³o pojawienie siê bia³ek

o nowych w³aœciwoœciach bioche-

micznych, których przejawem by³y

wartoœci pI bia³ek w zakresie pH obo-

jêtnego, a szczególnie zasadowego.

Dotyczy³o to zw³aszcza polipeptydów

w przedziale mas cz¹steczkowych od

20 do 40 kDa i od 40 do 90 kDa.

Rezultaty analiz iloœciowych pro-

fili polipeptydowych plazmy nasienia

z uwzglêdnieniem wieku knurów

przedstawia ryc. 2A. W analizowa-

nych próbkach plazmy nasienia ob-

serwowano, potwierdzony statystycz-

nie, wzrost ogólnej liczby polipepty-

dów wraz z up³ywem wieku knurów,

odpowiednio, od 72 w wieku 1 roku

do 125 w wieku 3 lat. U osobników

w wieku 3,5 roku stwierdzono tylko

nieznaczny wzrost liczby polipepty-

dów. Na podkreœlenie zas³uguje fakt

istotnego wzrostu liczby polipepty-

dów u osobników 3-letnich, szczegól-

nie w przedziale mas cz¹steczkowych

od 20 do 40 kDa. Równie¿ w pozo-

sta³ych grupach (> 20 kDa, 40-90

kDa) najwy¿sz¹ liczbê polipeptydów

obserwowano u osobników w wieku

3-3,5 roku.

Wyniki badañ wskazywaæ mog¹ na

osi¹gniêcie pe³nej zdolnoœci sekrecyj-

nej dodatkowych gruczo³ów p³cio-

wych knura w wieku oko³o 3 lat. Zja-

wisko to zapewne dotyczy szczegól-

nie gruczo³ów pêcherzykowych, które u knura s¹ g³ów-

nym Ÿród³em bia³ek plazmy nasienia (15).

Jak wynika z danych przedstawionych na ryc. 2B,

najwy¿sz¹, potwierdzon¹ statystycznie, liczbê polipep-

tydów obserwowano w okresie jesiennym – 122, naj-

ni¿sz¹ w letnim – 84. W okresie zimowym i wiosen-

nym zanotowano wartoœci poœrednie. Wyniki takie

dotyczy³y wszystkich grup analizowanych polipepty-

dów, niezale¿nie od ich masy cz¹steczkowej. Tym nie-

mniej istotny wzrost liczby polipeptydów w okresie

jesiennym stwierdzono w grupach w przedziale mas

cz¹steczkowych 20-40 kDa i 40-90 kDa, odpowied-

nio: 55 i 56. Natomiast dla okresu letniego wartoœci te

7,4

7,4

3

5

7

9

10

40-90

kDa

(24*)

40-90

kDa

(49*)

20-40

kDa

(16*)

20-40

kDa

(53*)

£

20

kDa

(12*)

£

20

kDa

(29*)

3

5

7

9

10

94,0

67,0

45,0

30,0

20,1

14,4

14,4

94,0

67,0

45,0

30,0

20,1

Mr

(kDa)

Mr

(kDa)

pH

pH

A.

B.

Ryc. 1. Elektroforeza dwukierunkowa (2-D) bia³ek plazmy nasienia knura w wie-

ku 12 miesiêcy (A) i 36 miesiêcy (B)

Objaœnienia: * – liczba polipeptydów

Medycyna Wet. 2008, 64 (2)

226

wynosi³y, odpowiednio, 36 i 37 poli-

peptydów. Obserwowane zjawisko

wskazywaæ mo¿e na sezonow¹

zmiennoœæ w zakresie aktywnoœci

translacyjnej dodatkowych gruczo³ów

p³ciowych knura. Nale¿y nadmieniæ,

i¿ ejakulaty kolekcjonowane w mie-

si¹cach letnich charakteryzuj¹ siê ob-

ni¿on¹ jakoœci¹, natomiast jesieni¹

wykazuj¹ najwy¿sz¹ wartoœæ biolo-

giczn¹ (16).

W posumowaniu nale¿y stwierdziæ,

¿e zmodyfikowana metoda elektrofo-

rezy dwukierunkowej (2-D) mo¿e byæ

z powodzeniem stosowana w anali-

zie bia³ek plazmy nasienia knura.

Z kolei uwarunkowany wiekiem knu-

rów i por¹ roku polimorfizm map po-

lipeptydowych plazmy nasienia knu-

ra mo¿e byæ wykorzystany jako mar-

ker molekularnych zmian aktywnoœci

sekrecyjnej dodatkowych gruczo³ów

p³ciowych. Stanowiæ mo¿e zarazem

istotny wyznacznik kwalifikacji sam-

ców do rozrodu.

Piœmiennictwo

1.Brandon C. I., Heusner G. L., Caudle A. B., Fayrer-

-Hosken R. A.: Two-dimensional polyacrylamide gel

electrophoresis of equine seminal plasma proteins

and their correlation with fertility. Theriogenology

1999, 52, 863-873.

2.Desnoyers L., TherienI., Manjunath P.: Characteri-

zation of the major proteins of bovine fluid to two-

-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis.

Mol. Reprod. Dev. 1994, 37, 425-435.

3.Cardozo J. A., Fernandez-Juan M., Forcada F.,

Abecia A., Muini-Blanco T., Cebrian-Perez J. A.:

Monthly variations in ovine seminal plasma pro-

teins analyzed by two-dimensional polyacrylamide

gel electrophoresis. Theriogenology 2006, 66, 841-

-850.

4.Flowers W. L.: Relationships between seminal

plasma proteins and boar fertility. Ann. Swine Rep.

2001, 1-4.

5.Fraser L., Dziekoñska A., Strze¿ek J., Strze¿ek R.: Dialysis of boar semen

prior to freezing-thawing: Its effect on post-thaw sperm characteristics.

Theriogenology 2007 (w druku).

6.Heukeshoven J., Dernick R.: Simplified method for silver staining of pro-

teins in polyacrylamide gels and the mechanism of silver staining. Electro-

phoresis 1985, 6, 103-112.

7.Killian G. J., Chapman D. A., Rogowski L. A.: Fertility-associated proteins

in Holstein bull seminal plasma. Biol. Reprod. 1993, 49, 1202-1207.

8.Laemmli U. K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the

head bacteriophage T4. Nature 1970, 277, 680-685.

9.Mc Dowell K. J., Little T. V., Timoney P. J., Adams M. H.: Characterization of

proteins in the seminal plasma of stallions, geldings and geldings supple-

mented with testosterone. Res. Vet. Sci. 61, 33-37.

10.O’Farrel P. Z., Goodman H. M., O’Farrel P. H.: High resolution of two-

-dimensional electrophoresis of basic as wall as acidic proteins. Cell 1977,

12, 113-142.

11.Panisko E. A., Conrads T. P., Goshe M. B., Veenstra T. D.: The postgenomic

age: Characterization of proteomes. Exp. Hemat. 2002, 30, 97-107.

12.Shivaji S., Scheit K. H., Bhargava P. M.: Proteins of Seminal Plasma.

A Willey-Interscience Publications, New York 1990.

13.Strze¿ek J.: Nasienie i u¿ytkowanie rozp³odowe knura, [w:] Wierzbowski S.

(red.): Andrologia. Platan-Kryspinów 1996, 201-217.

14.Strze¿ek J.: Plazma nasienia a niektóre funkcje biologiczne plemników. Post.

Biol. Kom. 1999, 26, 59-68.

15.Strze¿ek J.: Secretory activity of boar seminal vesicle glands. Biol. Reprod.

2002, 2, 243-266.

16.Strze¿ek J., Demianowicz W., Luberda Z., Torska J.: The effect of season on

acrosin activity and plasmolemma susceptibility of boar spermatozoa. Proc.

12

th

Int. Congess Anim. Reprod. The Hague, Netherlands 1992, 4, 532-534.

17.Strze¿ek J., Wysocki P., Kordan W., Kukliñska M., Mogielnicka M., Soli-

woda D., Fraser L.: Proteomics of boar seminal plasma – current studies and

possibility of their application in biotechnology of animal reproduction.

Reprod. Biol. 2005, 5, 279-290.

18.Weichselbaum T. E.: An accurate and rapid method for the determination of

proteins in small amounts of blood serum and plasma. Am. J. Clin. Path.

Techn. Sekt. 1946, 10, 40.

Adres autora: dr hab. W³adys³aw Kordan, prof. nadzw. UWM, ul. Ocza-

powskiego 5, 10-718 Olsztyn; e-mail: w³adys³[e-mail]

Ryc. 2. Wp³yw wieku knurów (A), (n = 12) oraz pory roku (B), (n = 12) na liczbê

polipeptydów plazmy nasienia knura po elektroforezie 2D

Objaœnienia: a, b, A, B, C – œrednie oznaczone ró¿nymi literami ró¿ni¹ siê istotnie:

ma³ymi przy p £ 0,05; du¿ymi przy p £ 0,01

A.

0

10

20

30

40

50

60

70

100

130

160

Liczba

polipeptydów

Liczba

polipeptydów

Liczba

polipeptydów

Liczba

polipeptydów

0

10

20

30

40

50

60

70

100

130

160

>20 kDa

20-40 kDa

40-90 kDa

a

b

a

a

b b

b

b

a

S

B.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

120

160

0

10

20

30

40

50

60

70

80

120

160

>20 kDa

20-40 kDa

40-90 kDa

A

B

A

A

A

C

C

B

B

B

B

B

B

B

B

B

S

jesieñ

zima
wiosna
lato

12 miesiêcy

24 miesi¹ce
36 miesiêcy
42 miesi¹ce