4 wykład Politechnikia 2012 [tryb zgodności]

Biochemia

KWASY NUKLEINOWE

Anna Bilsk

CM UJ

wykład 4

Anna Bilsk

CM UJ

Anna Bilsk

CM UJ

Cząsteczka rybozy i deoksyrybozy pochodzi z przemian glukozy

Cząsteczka rybozy i deoksyrybozy pochodzi z przemian glukozy
Atomy azotu i węgla zasad purynowych i pirymidynowych

Atomy azotu i węgla zasad purynowych i pirymidynowych pochodzą

pochodzą

z aminokwasów

INFORMACJA GENETYCZNA

Informacja genetyczna przechowywana

jest w komórkach w postaci

cząsteczek

DNA

, tylko u niektórych

wirusów w postaci RNA (retrowirusy).

Informacja jest zaszyfrowana

Anna Bilsk

CM UJ

Informacja jest zaszyfrowana

w sekwencji deoksyrybonukleotydów

zawierających zasady A, G, C, T.

Kod jest trójkowy: trzy kolejne

nukleotydy kodują określony

aminokwas.

Anna Bilsk

CM UJ

STRUKTURA DNA

Anna Bilsk

CM UJ

-ACGT-3

Anna Bilsk

CM UJ

Anna Bilsk

CM UJ

Anna Bilsk

CM UJ

DNA

Anna Bilsk

CM UJ

Rosalind Franklin

Pracowała w King

s College wraz z

Mauricem Wilkinsem.Jej autorstwa

był dokładny rentegenogram

sodowej soli DNA, który legł u

podstaw pracy Jamesa Watsona i

Francisa Cricka (laureaci wraz

Maurice Wilkinsem Nagrody

Nobla).

DNA

Anna Bilsk

CM UJ

Nobla).

Mimo iż była ona niewątpliwie

współtwórcą odkrycia struktury

DNA, jej nazwisko nie zostało

uwzględnione w werdykcie Komitetu

Noblowskiego, gdyż nie żyła już

w momencie przyznania nagrody

Crickowi, Watsonowi i Wilkinsowi.

Molecular structure of Nucleic Acids:
A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid –
James Watson, Francis Crick;
Nature, 25 April, 1953

Była to pierwsza publikacja opisująca odkrycie
struktury podwójnej spirali DNA .

Anna Bilsk

CM UJ

Większość danych, na których się oparli
pochodziła od Maurice`a Wilkinsa
i Rosalind Franklin z King`s College w Londynie
.

PODSTAWOWY DOGMAT GENETYKI

DNA → RNA → Białko

Anna Bilsk

CM UJ

RNA

Anna Bilsk

CM UJ

RNA

Anna Bilsk

CM UJ

Anna Bilsk

CM UJ

Synteza białka wymaga przetłumaczenia

języka kwasów nukleinowych na język białka

Anna Bilsk

CM UJ

języka kwasów nukleinowych na język białka

INFORMACJA GENETYCZNA

Informacja genetyczna przechowywana

jest w komórkach w postaci

cząsteczek

DNA

, tylko u niektórych

wirusów w postaci RNA (retrowirusy).

Informacja jest zaszyfrowana

Anna Bilsk

CM UJ

Informacja jest zaszyfrowana

w sekwencji deoksyrybonukleotydów

zawierających zasady A, G, C, T.

Kod jest trójkowy: trzy kolejne

nukleotydy kodują określony

aminokwas.

Kod genetyczny

Anna Bilsk

CM UJ

Anna Bilsk

CM UJ

Translacja

Anna Bilsk

CM UJ

Translacja

Anna Bilsk

CM UJ

Anna Bilsk

CM UJ

MUTACJE

Anna Bilsk

CM UJ

HbA

DNA

GTG CAC CTG ACT CCT

GAG

GAG AAG

mRNA

GUG CAC CUG ACU CCU

GAG

GAG AAG

białko

Val

His

Leu Thr

Pro

Glu

Lys

Analiza genu HbA i HbS

Anna Bilsk

CM UJ

HbS

DNA

GTG CAC CTG ACT CCT

GTG

GAG AAG

mRNA GUG CAC CUG ACU CCU

GUG

GAG AAG

białko

Val

His

Leu Thr

Pro

Val

Glu

Lys

Anna Bilsk

CM UJ

Anna Bilsk

CM UJ

Wpływ delecji w genie na sekwencję nukleotydów

w transkrypcie mRNA i na sekwencje

aminokwasów w białku

Stan normalny

UAG UUUG AUG GCC UCU UGC AAA GGC UAU AGU AGU UAG

Met-Ala- Ser- Cys- Lys –Gly –Tyr -Ser-Ser –STOP

Delecja (-1)

(-1 U)

Anna Bilsk

CM UJ

Delecja (-1)

(-1 U)

↓

UAG UUUG AUG GCC CUU GCA AAG GCU AUA GUA GUU AG..

Met-Ala-Leu- Ala- Lys – Ala –Thr – Val –Val -Ser

Delecja (-3)

(-3 UGC)

↓

UAG UUUG AUG GCC UCU AAA GGC UAU AGU AGU UAG

Met-Ala- Ser-Lys –Gly –Tyr -Ser-Ser –STOP

Wpływ insercji w genie na sekwencję
nukleotydów w transkrypcie mRNA i na

sekwencje aminokwasów w białku

Stan normalny

UAG UUUG AUG GCC UCU UGC AAA GGC UAU AGU AGU

UAG

Met-Ala- Ser- Cys- Lys –Gly –Tyr -Ser-Ser

STOP

Insercja (+1)

(+1 C)

Anna Bilsk

CM UJ

Insercja (+1)

(+1 C)

↓

UAG UUUG AUG GCC CUC UUG CAA AGG CUA

UAG

UAG UUAG

Met-Ala- Leu- Leu -GLn Arg – Leu

STOP

Wpływ delecji i insercji w genie na sekwencję

nukleotydów w transkrypcie mRNA i na

sekwencje aminokwasów w białku

Stan normalny

UAG UUUG AUG GCC UCU UGC AAA GGC UAU AGU AGU

UAG

Met-Ala- Ser- Cys- Lys –Gly –Tyr -Ser-Ser

STOP

Anna Bilsk

CM UJ

Insercja (+1)

Delecja (-1)

(+1 U) (-1 C)

↓

UAG UUUG AUG GCC UCU UUG CAA AGG UAU AGU AGU

UAG

Met-Ala- Ser- Leu- Gln –Arg –Tyr -Ser- Ser

STOP

Anna Bilsk

CM UJ

Anna Bilsk

CM UJ

Mukowiscydoza należy do najczęstszych chorób dziedzicznych

Mukowiscydoza należy do najczęstszych chorób dziedzicznych
występujących u rasy białej. Co 25 Europejczyk jest nosicielem

występujących u rasy białej. Co 25 Europejczyk jest nosicielem
patologicznego genu. Kodowane przez ten gen białko pełni rolę w

patologicznego genu. Kodowane przez ten gen białko pełni rolę w
regulacji funkcji kanału chlorkowego w drogach oddechowych.

regulacji funkcji kanału chlorkowego w drogach oddechowych.
Przyczyną ponad 90% przypadków upośledzenia funkcji życiowych

Przyczyną ponad 90% przypadków upośledzenia funkcji życiowych
i śmierci chorych są zmiany oskrzelowo płucne.

i śmierci chorych są zmiany oskrzelowo płucne.

sekwencja nukleotydów w DNA

Anna Bilsk

CM UJ

sekwencja nukleotydów w DNA

prawidłowa

````````

--------

ATC ATC TTT GGT

---- 3

````

nieprawidłowa

````````

--------

ATC ATT GGT GTT

---- 3

````

Anna Bilsk

CM UJ

Rasa biała

1:2500

Rasa żółta

1:90 000

Anna Bilsk

CM UJ

Rasa czarna

1:17 000

Wydzielanie bardzo słonego potu jest wczesnym
objawem chorobowym, a pomiar stężenia chlorków w wydalanym
pocie jest jednym z kryteriów diagnostycznych choroby

Anna Bilsk

CM UJ

Anna Bilsk

CM UJ

TECHNIKI BIOLOGII

MOLEKULARNEJ

RFLP

RFLP -

- POLIMORFIZM DŁUGOŚCI

POLIMORFIZM DŁUGOŚCI

FRAGMENTÓW RESTRYKCYJNYCH

Anna Bilsk

CM UJ

PCR

PCR -

- POLIMERAZOWA REAKCJA

POLIMERAZOWA REAKCJA

ŁAŃCUCHOWA

POLIMORFIZM DŁUGOŚCI FRAGMENTÓW

RESTRYKCYJNYCH RFLP

(

Restriction fragment length polymorphism)

•

Jest wynikiem punktowych mutacji, występujących
w obrębie genu.

•

Mutacje mogą powodować albo powstawanie nowych
albo utratę istniejących miejsc rozpoznawanych przez

Anna Bilsk

CM UJ

albo utratę istniejących miejsc rozpoznawanych przez
enzymy restrykcyjne.

•

Enzymy restrykcyjne tną DNA na fragmenty
o zróżnicowanej długości.

•

Rozdział elektroforetyczny tych fragmentów pozwala
na wykrywanie różnic występujących pomiędzy
różnymi cząsteczkami DNA.

Anna Bilsk

CM UJ

Madam I

am Adam

Anna Bilsk

CM UJ

Analiza długości fragmentów restrykcyjnych

Anna Bilsk

CM UJ

POLIMORFIZM DŁUGOŚCI FRAGMENTÓW

RESTRYKCYJNYCH (RFLP)

Anna Bilsk

CM UJ

DIAGNOSTYKA GENETYCZNA

FENYLOKETONURII

Anna Bilsk

CM UJ

30 kpz

20 kpz

Anna Bilsk

CM UJ

ojciec chorej

2. matka chorej
3. chora na
fenyloketonurię.
4. brat chorej;
5. siostra chorej.

W badanej rodzinie występuje
polimorfizm fragmentów restrykcyjnych
DNA (o wielkości 30 kpz i 20 kpz),
obejmujący odcinek kodujący
hydroksylazę fenyloalaninową (HPA),
wywołany zmianą miejsca
rozpoznawanego przez enzym
restrykcyjny [dziedziczenie
autosomalne recesywne (HPA)]

30 kpz

20 kpz

Chora odziedziczyła od ojca i matki zmutowany allel 20

Anna Bilsk

CM UJ

Chora odziedziczyła od ojca i matki zmutowany allel 20

kpz, ale brak jej prążka 30 kpz warunkującego

występowanie prawidłowego genu HPA;

jej brat odziedziczył allel zmutowany 20 kpz i allel

prawidłowy 30 kpz, jest więc heterozygotą

(nosicielem);

siostra chorej odziedziczyła dwa prawidłowe allele

Anna Bilsk

CM UJ

Praktyczne wykorzystanie wła

ciwo

Praktyczne wykorzystanie wła

ciwo

fizyko

fizyko--chemicznych białek

chemicznych białek -- PODSUMOWANIE

PODSUMOWANIE

∙

steczki obdarzone ładunkiem maj

zdolno

ść

poruszania si

w polu elektrycznym: aniony w

druj

do anody, kationy do

katody. Zjawisko to nazywamy elektroforez

∙

Mutacje mog

prowadzi

do zmiany składu aminokwasowego

Anna Bilsk

CM UJ

∙

Mutacje mog

prowadzi

do zmiany składu aminokwasowego

białek. To powoduje,

e białko zmutowane mo

e mie

inny

ładunek ni

białko natywne. Oba białka (natywne i zmutowane)

c ró

szybko

(a czasem i kierunkiem)

drówki w polu elektrycznym.

∙

Elektroforez

białek mo

na wi

c wykorzystywa

do celów

diagnostyki klinicznej (np.HbA i HbS)

POLIMERAZOWA REAKCJA ŁAŃCUCHOWA

- PCR (

Polymerase Chain Reaction

)

„molekularna kserokopiarka”

•

metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach
laboratoryjnych;

•

do reakcji wprowadza się: matrycowy DNA, który
chcemy powielić (amplifikacja), trifosforany

Anna Bilsk

CM UJ

chcemy powielić (amplifikacja), trifosforany
deoksyrybonukleotydów: dATP, dGTP, dCTP, dTTP,
startery (primery), czyli krótkie (najczęściej ok. 20
nukleotydów) fragmenty DNA komplementarne do
fragmentów matrycy, termostabilną polimerazę
DNA;

•

Cykl: denaturacja, przyłączenie starterów, elongacja

•

Cykl się powtarza, przyrost DNA w postępie
geometrycznym; po n cyklach otrzymujemy 2

cząsteczek.

Anna Bilsk

CM UJ

PCR

Anna Bilsk

CM UJ

Analiza genu dystrofiny, największy opisany gen
(75 eksonów i 74 introny). Defekt tego białka
prowadzi do dystrofii mięśni. 1:3500; płeć męska.
Defekt jest spowodowany delecją egzonów genu.

Zasada wykrywania delecji egzonów w genie
dystrofiny metodą PCR.Amplifikacja kilku do kilkunastu

Anna Bilsk

CM UJ

dystrofiny metodą PCR.Amplifikacja kilku do kilkunastu
wybranych egzonów z regionów genu,w których
najczęściej występuje mutacja. Jeżeli brak egzonu, to
nie nastąpi jego powielenie i nie pojawi się ten
fragment w obrazie elektroforetycznym

1:3500

Anna Bilsk

CM UJ

Jest to letalna postać zaników mięśniowych. Objawy
choroby są zauważalne dopiero w wieku 3-5 lat. Zmiany
dotyczą również mięśnia sercowego. Do niedawna chorzy
umierali w wieku około 10 lat. Obecnie dzięki postępom
medycyny dożywają do 20-30 lat