27.01.09

Problem

elucji

(wymywania)

w

chromatografie.
RYSUNEK



Trzy pary związków oddziałują podobnie z
fazą stacjonarną. Jeśli zoptymalizujemy
pomiar względem 1. pary to pozostałe nie
będą zoptymalizowane, względem 2 lub 3 to
inne nie. Dlatego po wymyciu dwóch pików
następuje zmiana parametrów dynamicznych
wymywania

–

zastosowanie

elucji

gradientowej (zmienna w czasie)
Zastosowanie chromatografii
Czołowa metoda rozdzielania i wydzielania
substancji ma znaczenie jakościowe i
ilościowe.
Chromatograficzna

analiza

jakościowa:

identyfikacja substancji poprzez czasy elucji;
etam wstępny do dalszej identyfikacji.
Oczyszczona

substancja

chromatografia

może być sprzężona ze spektroskopią.
Jeśli związki są podobne ie jesteśmy w
stanie określić t

R

. W szczególności gdy

czasy retencji są wykalibrowane np. dla
aminokwasów od 1 zastrzyku możemy
określić z jakimi aminokwasami mamy do
czynienia. Nieobecność piku może nieść w
sobie informację analityczne

ważne w

analizie antydopingowej.
Analiza ilościowa: właściwości sprawiły że
technika ta rozwija się bardzo szybko,
oznaczania ilościowe są :
-szybkie
-stosunkowo proste
-niskie koszty
-szeroko

stosowane

jako

narzędzie

rozdzielania.
Aby oznaczyć ilościowo potrzebna jest
wysokość piku i jego pole powierzchni.
Zalety i wady stosowania wysokości piku:
-łatwiej zmierzyć wysokość niż pole.
- pomiar wysokości jest dokładną miarą
ilościową stężenia składu jeżeli warunki
rozdzielania są stałe w trakcie analizy nie
zmienia

się

szerokość

piku

(miara

powtarzalności.

-jeżeli piki są bardzo mocne to pomiar
wysokości jest dokładniejszy niż pola.
Warunki powtarzalności rozdziału:
- powtarzalność objętości zastrzyku
- T kolumny
- szybkość przepływu fazy ruchomej
- efekt przeładowania kolumny nadmierne
ogrzewanie lub powstawanie frontu.
Analiza ilościowa za pomocą powierzchni
pod pikiem
- efekt poszerzenia pasma nie odgrywa roli
powierzchnia piku nie jest na to czuła.
Sposoby realizacji analizy ilościowej:

a)

konstruowanie krzywej kalibracyjnej
substancje o kilku stężeniach –
wykreślamy prostą zależności czasu
retencji od stężenia. Krzywa nadaje
się jeśli obejmuje zakres stężenia w
badanych próbkach.

b)

Metoda wzorca wewnętrznego –
najdokładniejsze

oznaczenia

ilościowe.

Można

skompresować

błędy, warunki poprawiane stosując
wewnętrzny wzorzec. Wzorcem nie
musi być substancja oznaczana, w
związku z tym substancję wzorcową
dobiera się w tak aby wymywała się
dostatecznie blisko naszego piku o
R

S

>1,25,precyzja lepsza niż 1%.

c)

Normalizacja powierzchni piku –
prowadzi

do

wyznaczenia

bezwzględnego składu mieszaniny,
unika się niedokładności związanych
z

zastrzykiwaniem

próbki.

Warunkiem jest pełne wymycie.
Mierzymy

powierzchnię

pod

wszystkimi

pikami

(ZESZYT

STRONA

3

NIE

MOGĘ

ROZCZYTAĆ

CO

JEST

W

NAWIASIE)

Wyznacza

się

względne stężenie w mieszaninie. Ile
% substancji x pobranej do analizy.
Jeśli mamy c bezwzględne innych
substancji to możemy podać c
bezwzględne substancji x. Źródła
błędu:

- niedokładne objętości zastrzykiwanej
próbki
- różna szybkość zastrzykiwania.

Podział chromatografii ze względu na
f. ruchomą
Chromatografia gazowa GC – odnosi się
do

dwóch

różnych

technik

w

zależnościom f. stacjonarnej:
Ciało stałe- mamy do czynienia z Gas
Solid Chromatography (GSC)
Ciecz – Gas liquid chromatography GLC
GSC nie jest już techniką stosowaną
praktycznie. W GSC mechanizm retencji
opiera się na adsorpcji fizycznej.
Dlaczego GSC stosuje się szczątkowo:
Retencja

jest

prawie,

że

trwała,

występuje znaczne ogonowanie piku
wynikające

z

charakteru

izotermy

adsorpcji.
GC – podział dotyczy obecności
substancji w stanie gazowym lub
ciekłym w każdej chromatografii mamy
do czynienia z faza ruchomą i
stacjonarną oraz próbką. TU JEST
RYSUNEK ALE GO NIE ROZUMIEM
WIĘC POMIJAM STRONA 4 ZESZYT
GLC
Parametrem retencji jest V

R

- objętość

retencji
V

R

=t

R

*F

F-szybkość przepływu objętościowego.
V

M

=t

M

*F

T

C

- temperatura kolumny [K]

T – temperatura miernika

p

p

p

T

T

F

F

O

H

C

m

)

(

2

−

=

p-ciśnienie pary wodnej w temp. T
V

R

i V

M

zależą od średniego ciśnienia

panującego w kolumnie.

F

t

j

V

R

R

⋅

⋅

=

0

F

t

j

V

M

M

⋅

⋅

=

0

j- czynnik korygujący















−



























−













=

1

2

1

3

3

2

p

p

p

p

j

i

i

Specyficzna objętość retencji

=

⋅

−

=

C

M

R

df

g

T

W

V

V

V

273

0

0

(

)

C

M

R

T

W

t

t

F

j

273

⋅

−

⋅

Powiązanie współczynnika retencji ze
współczynnikiem rozdzielania:

M

M

R

t

t

t

k

−

=

'

;

C

S

C

M

C

M

g

T

W

KV

T

W

k

V

T

W

k

jFt

V

273

273

273

'

0

'

⋅

=

⋅

⋅

=

⋅

=

s

s

V

W

S

=

;

c

s

g

T

K

V

273

⋅

=

ρ

Przepływ pozostaje stały jeśli ciśnienie
jest stałe:
RYSUNKI



Aparatura:
- Regulator ciśnienia gazu
- zbiornik gazu
- miernik szybkości przepływu (kontrola
przepływu
- rotometr pomiar szybkości przepływu
gazu
- piec w piecu kolumna do jej czoła
przytwierdzone urządzenie dozujące.
-detektor

(czasami

potrzebny

tor

odniesienia)
-pomiar szybkości
- rejestrowany sygnał napięciowy.
Zbiornik z gazem- od czego zależy
wybór gazu? W większości decyduje
charakter detektora, różne detektory
wymagają różnych gazów. Cechą układu
podającego gaz nośny jest urządzenie
osuszające

gaz

(za

pomocą

sit

molekularnych).
Pomiar

szybkości

przepływu

–

urządzenie szydłowo bańkowe.
Sposób zastrzykiwania próbki-
Zastrzykujemy

do

komory

do

odparowania zawór dozujący najczęściej
pętlicowe sześciopozycyjne (LC i GC)
Szybkość 25-100 ml/min, 1-25ml/min
gołe ścianki kapilary.

Wymagania stawiane zastrzykiwaniem:
1)

dotyczą objętości próbki.

2)

Kształt profilu zastrzyku w czasie

RYSUNEK
Parametry operacyjne na kolumnie:
Kolumny upakowane lub otwarte. Mała
średnica k. kapilarne, z reguły k. otwarte
Podstawowe parametry: długość

w

zależności od potrzeb; zbudowana z
różnych

materiałów

(szkło,

stal

kwasoodporna, kwarc, teflon). Parametr
dynamicznej pracy kolumny w GC temp,
jak wpływa na sprawność kolumny.
Wprowadzono elucję gradientową gdzie
zmianie ulega T kolumny od 30 do 18°C.
Nowoczesne w sposób programowany.
Gdy mamy optymalną temperaturę
kolumny to rozdzielczości zadowalające
zalezą

od

temperatury

wrzenia

rozpuszczalnika i zadanej rozdzielczości.
T

wrz

<T

opt

<t

dvs

;

dvs – stopień pożądanego

rozdzielenia.
Optymalne rozdzielenie związane jest z
możliwe najniższą temperaturą jednak
niska temperatura to koszt, i dłuższy czas
wymywania.
Detektor:
Cechy detektora do GC
1)

określona wykrywalność – wystarcza
adekwatna czułość różna czułość do
różnych analiz, czynniki czułości
mogą się różnić o 10

7

. Czułość

powinna zawierać się między 10

-7

-

10

-15

g/s substancji.

2)

Stabilność i odwracalność pracy.

3)

Liniowość dopowiedzi – sygnał
proporcjonalny

do

stężenia

w

szerokim zakresie wielkości kilka
rzędów 1-10 tys.

4)

Zakres temperatury i łatwość obsługi

- nie można popsuć przy żadnej
nastawie.
-

toporny

nie

można

popsuć

mechanizmu.

5) Czas odpowiedzi – jak najkrótszy,
niezależnie od szybkości przepływu.
6) Wysoka rzetelność pracy i łatwość
obsługi.
7)Jego

odpowiedź

jest

jednakowa

względem

wszystkich

badanych

składników mieszaniny (ogólny) lub
wybranych (selektywny).
8) Nie destrukcyjny nie rozwala próbki
można ją poddać analizie na innym
przyrządzie.
Nie ma idealnego detektora do GC.
Oznaczamy stosując różne detektory.
Detektor

płomieniowo

jonizacyjny

FID.

–Istotą

jest

palnik

zasilany

wodorem i powietrzem po iskrowym
zapaleniu palnika - H

2

pali się, dysza

uziemiona do kolektora jest przyłożone
napięcie kilkuset V. Spalaniu substancji
organicznej w płomieniu towarzyszy
jonizacja

–

wytwarzanie

jonów

i

elektrolitów. Wyprodukowane ładunki
poruszają się w polu elektrycznym( kilka
mA) i płynie prąd. Nie wiemy dlaczego
substancje ulegają jonizacje w trakcie
spalania. Detektor jest czuły na masę
zastrzykiwanej próbki. Liczby at. C
przepływają

przez

detektor,

nie

morzymy stężeń. Jest czuły na masę
jego wskazania nie zalezą od szybkości
przepływu fazy ruchomej. Wysoka
czułość

10

-13

g/s,

szeroki

zakres

liniowości 7 rzędów 10

7

. Szum jest niski,

odporny na głupotę, nie jest czuły na
substancję

które

się

nie

spalają.

(zawierające metal lub niemetal na
wysokim stopniu utlenienia) Detektor
ogólnego przeznaczenia do oznaczania
substancji organicznych. Wadą tego
detektora jest to że jest on destrukcyjny.
Detektor termojonowy TID
Budowa podobna do detektora FID,
wyciek (dotyczy płynów) jest mieszany z
wodorem, przepuszczamy nad palnikiem
i spalamy, gorący gaz przepływa nad
elektrycznie grzana kulką z krzemianu
rubidu – podłączone jest też napięcie
100mV ta kulka ziarna podgrzewana
wytwarza plazmę o temperaturze 600-
800 C. W plazmie nie wiadomo co się
dzieje. Powstaje bardzo dużo jonów,
źródłem

są

związki

azotu,

fosforoorganiczne. Zaletami detektora
jest:
- tworzenie dużej ilości jonów, prądy o
dużym

natężeniu,

nadają

się

do

oznaczania związków zawierających P i
N. Selektywny 10x bardziej czuły niż na
inne związki organiczne nie zawierające
P,N. Jest 500x bardziej czuły na P niż
FID, i 50x na N. Stosowany do
oznaczania pestycydów w glebie.
Detektor płomieniowo fotometryczny
FPD
Wyciek z kolumny przepuszczamy nad
niskotemperaturowym

płomieniem

wodorowym.

W

trakcie

spalania

przetwarza związki fosforoorganiczne na
związki

zawierające

HPO

to

się

charakteryzuje

emisją

(510-500nm),

siarka SO

2

394nm również halogenki,

związki metaloorganiczne Se,Ge.
Zastosowanie

szerokie

w

analizie

zanieczyszczeń

powietrza

i

H

2

O,

wywołanych

pestycydami.

Detektor

selektywny reaguje na obecność S i P.
Detektor

przewodnictwa

cieplnego

TCD
Katharometr jeden z pierwszych wciąż
stosowany, zasada działania związana ze
zmianami przewodnictwa cieplnego gazu
związane z pojawieniem się próbki w
gazie.

Elementem

pracującym

jest

grzana spirala ogrzewana ze źródła
prądu

o

stałej

mocy,

powinna

przewodzić prąd o tej samej oporności

jest tak gdy otacza ją jednorodny gaz,
oporność

drutu

jest

miarą

przewodnictwa cieplnego gazu nośnego.
Co jeśli w gazie będzie próbka ?
Dołączone jest urządzenie pomiarowe
typu mostka. Jeśli w gazie będzie próbka
to

substancja

oznaczana

inaczej

odprowadza ciepło – zmienia się
oporność tego druciku. Mamy tor próbki
i tor odniesienia. Układ mostkowy
zapewnia pomiar porównawczy zaletą
jest to że wskutek pomiaru różnicowego
eliminowane są efekty szybkości zmian
przepływu ciśnienia zasilenia. Gazem
nośnym jest H

2

lub He bo ich

przewodnictwo jest 6-10x większe niż
związków organicznych. Więc gdy w
gazie

jest

niewielka

ilość

próbki

organicznej

to

gwałtownie

spadnie

zdolność

odprowadzenia

ciepła,

temperatura drutu wzrośnie. Zaletami są
prostota

obsługi,

szeroki

zakres

liniowości

dynamicznej.

Detektor

ogólnego

przeznaczenia

substancje

organiczne i nieorganiczne nie jest
destrukcyjny.
Ograniczenia: niska czułość 10

-8

g/ml

gazu

nośnego,

inne

przewyższają

katharometr o 4-7 rzędów wielkości.
Przy tak niskiej czułości nie nadaje się
do zastosowania w przypadku kolumn
kapilarnych.
Detektor wychwytu elektrolitów
Wyciek z kolumny przepuszczany nad
substancją emitującą promieniowanie β
najczęściej

63

Ni lub tryt, są one drogie,

naniesione

na

folie

platynową.

Promieniowanie β jonizuje gaz nośny
(azot) produkuje ogrom elektronów. Jeśli
nie ma substancji oznaczanej to mierzy
się stały prąd pomiędzy parą elektrod.
Jeśli

będzie

próbka

prąd

spadnie

substancje organiczne mają zdolność
wychwytu

elektronów.

Odpowiedź

detektora

jest

nieliniowa,

jeśli

przykładany

potencjał

nie

jest

impulsowy.

Selektywny

czuły

na

substancje zawierające elektroujemne
grupy funkcyjne: nadtlenki, chinony,
grupy nitrowe. Nie czuły na grupy
funkcyjne

węglowodory,

aminowe,

hydroksylowe. Zastosowanie: najczęściej
oznaczanie związków owadobójczych,
pochodnych

chlorowców.

Zalety:

czułość quasi nieniszczący charakter.
Nieliniowa

odpowiedź

–

zakres

liniowości detektora jest ograniczony do
dwóch rzędów wielkości.
Detektor emisji atomowej AED
Wyciek wprowadzany do komory pieca
mikrofalowego gdzie wytwarzana jest
plazma, komora sprzężona jest ze
spektrometrem jonowo optycznym. W
plazmie następuje atomizacja próbki
ulegają

wzbudzeniu

mają

widmo

emisyjne. Mamy diody przy określonej
długości

fali

emisja

pierwiastków,

możemy wykryć to co chcemy mierzyć.
Jeśli nastawimy na zakres węglowy
można badać benzyny. Substancja

anstystukowa

MTBF,

w

zakresie

tlenowym.

19.02.09.

Detektor fotojonizacyjny PID
Jonizacja

dokonywana

za

pomocą

światła ultrafioletowego (149-196nm)
jonizuje się cząsteczki, wybija elektrony,
przykłada się różnice potencjału i
uzyskuje się prąd jonizacyjny i rejestruje
przez

krzywą.

Jest

to

detektor

selektywny,

wysokoczuły

względem

wybranych substancji.

Detektory służą do detekcji, ilościowego
oznaczania substancji a na podstawie
czasu retencji wzorca możemy oznaczyć
tę substancję. Często należy połączyć
chromatografię z innym technikami
pozwalającymi

oznaczyć

badaną

substancję.

GC-MC
MS- wyznaczanie stosunku masy do
ładunku.

Po

sposobie

fragmentacji

można rozróżnić z jaką cząsteczką ma
się

do

czynienia.

Zastosowano

urządzenie:
Separator dyfuzyjny – w separatorze
tego typu cząsteczki gazu nośnego
odpompowywane przez rurę ze spieku
szklanego.
Separator- rozdzielcza strumienia, lekkie
cząsteczki

gazu

nośnego

są

odparowywane przy przejściu z jednej
kapilary do drugiej a ciężkie gazy próbki
trafiają do drugiej kapilary i do MS.
Separator membranowy – membrana jest
organofilowa i związki organiczne są
transportowane przez membranę szybciej
aniżeli cząsteczki gazu nośnego.

Kolumny

kapilarne-

wymagają

stosowania mniejszych ciśnień dlatego
mogą być bezpośrednio połączone z MS,
gdy nie możemy zastosować ich to
stosujemy separator.
3 sposoby realizacji:

•

Kwadrupolowy MS

•

MS z transformatą Fouriera

•

Detektor pułapkowania jonów
ITD.

o

Zderzenia elektronowe

o

Jonizacja chemiczna

powstają jony

pułapkowane

w

polu

o

częstości

radiowej

są wrzucane do powielacza

eketronowego.

Zalety: niewielki,15 cm długości, tani.
Detektory MS mają szereg sposobów
prezentacji wyników, obróbka sygnału w
czasie rzeczywistym lub rekonstrukcja
komputerowa sygnału. Możemy wybrac do
prezentacji całkowity prąd (suma prądów
wszystkich

jonów)

lub

wykreślany

selektywnie prąd jonów.

Zastosowania GC-MS
GC-IR – problem z połączeniem rozwiązany
za pomocą rury świetlnej. Grubościenna
rura ze szkła, wewnątrz pokryta lustrem
złotym, próbka przechodząca odbija się od
ściany,

światło

podczerwone

jest

absorbowane przez próbkę.
Detektor IR- rtęciowo-kadmowy/tlenowy
tzw

radiacyjny;

elucja

gradientowa,

kolejność wymywania określone przez masę
cząsteczki,

masa

cząsteczkowa

rośnie.

Selektywność

może

określić

różnica

temperatur wrzenia substancji oznaczanej.
Widmo tej samej substancji w fazie gazowej
różni się od widma w fazie skondensowanej
(możliwe oscylacje, wyhamowane rotacje).
W

fazie

gazowej

nie

występuje

oddziaływania

między

cząsteczkami

charakterystyczne dla fazy skondensowanej
a zwłaszcza wiązanie wodorowe; nie ma
rozpuszczalnika.

Kolumny – historycznie wypełnione złożem
(nośniki) pokryte ciekłą fazą stacjonarną.
Zdano

sobie

sprawę,

że

kolumny

niepakowne o małej średnicy powinny
wykazywać znacznie lepszą sprawność niż
k. ze złożem (N nawet 300 tyś). Wady:
należało zastrzykiwać bardzo małą objętość
próbki ( trudne w sposób odwracalny),
bardzo delikatne, łamliwe. Problemy z
podaniem

próbki

na

taką

kapilarę,

połączenie jej z detektorem. Trudności z
odtwarzalnym pokryciem środka, niedługi

czas życia, tendencja do zapychania,
obłożone patentami.
Kolumny

upakowane-

wykonane

z

materiału szklanego lub metalowego (stal,
Cu) lub plastikowego. Długość 2-4m,
średnica wewnętrzna 2-4 mm. Upakowane
wypełnieniem cząsteczki stałe lub warstwa
pokrywa wewnętrzną powierzchnię kolumny
do 1µm.
Cechy materiału wypełniania kolumn:

o

Małe drobiny

o

Jednorodne

o

Sferyczne – dynamika przepływu

o

Odporne mechanicznie

o

Powierzchnia

specyficzna

(m

2

/g)

powinna być znaczna nie mniej niż
1m

2

/g.

o

Inertny nie oddziałuje z substancją
oznaczaną

o

Jednorodnie zwilżany przez ciecz
fazy stacjonarnej.

Z

wielkością

ziarna

związane

są

ograniczenia wynikające z zależności max
ciśnienia ze średnicą ziarna.

2

1

dp

p

≈

Jeśli przyjmując że p> 5 atm to kapilara
rozsadzi się. Zakres średnic 150-250 µm.
Kolumny kapilarne:
WCOT – kolumny otwarte z pokrytą
ścianką. Ścianka kapilary pokryte cieniutką
warstewką

fazy

stacjonarnej,

kolumny

stalowe lub plastikowe, później ze szkła
bromokrzemowego.

Ściany

kolumny

porowate.
SCOT – mogą przyjąć więcej substancji niż
WCOT, wadą jest ich niska sprawność,
kolumny otwarte pokryte nośnikiem.
FSOT - kolumny otwarte kwarcowe.
Mechanicznie

trwałe,

znacznie

mniej

relatywne względem składników próbki
rozdzielanej, mechanicznie elastyczne.
Ograniczenia

150-200µm

średnica

wewnętrzne, charakteryzują się większą
rozdzielczością aby zmniejszyć wielkość
zastrzykiwanej

próbki

stosuje

się

rozdzielacze.
Kolumny o dużej średnicy ich sprawność
jest niższa od kolumn o małych średnicach.
Można zastrzykiwać duże próbki.

Adsorpcja na materiale upakowania
kolumny i ściankach kapilary oraz
sposoby zapobiegania.
Mechanizm adsorpcji psuje mechanizm
rozdzielania. Adsorpcja fizyczna substancji
polarnych

tj.

alkoholi

węglowodory

aromatyczne na powierzchni krzemianów
wypełnienia lub ścianek. Skutkuje to
zniekształceniem pików

poszerzenie,

ogonowanie. Kolumny kwarcowe lepsze od
szklanych

bo

w

szkle

obecne

są

zanieczyszczenia (tlenki metali).
Wymagania względem fazy stacjonarnej:

1)

Lotność – idealna faza stacjonarna
charakteryzuje się t

wz

co najmniej o

100°C wyższą niż temperatura pracy
kolumny.

2)

Trwała w wyższych temperaturach

3)

Chemicznie obojętna (nie reaguje z
rozdzielanymi substancjami).

4)

Charakteryzuje

się

pożądanymi

parametrami rozdzielania k’ i α
wartości powinny zawierać się w
zakresie współczynniki referencji
rządzi współczynnik podziału.

Jakie ciecze jako faza stacjonarna?
Dobieramy fazę stacjonarną która jest
chemicznie podobna, wykazuje podobna
polarność.
W jaki sposób uzyskujemy polarność fazy
stacjonarnej wprowadzając grupy –CN, -CO,
-OH,

-CH

3

;

glikol

polietylenowy,

polisiloksany.
Krwawienie kolumny- wypłukuje się faza
stacjonarna – krwawi, sprawność spada.
Aby faza stacjonarna nie ulegała zubożeniu
należy ją trwale umocować.
Usieciowanie cieczy:
- sieciowanie rodnikowe – dodajemy
nadtlenki i grzejemy tę warstwę indukujemy
mechanizm reakcji rodnikowej powstaje
wiązanie C-C.
- indukowanie reakcji wolnorodnikowej
radiacyjnie:

kolumnę

pokrytą

fazą

stacjonarną poddajemy promieniowaniu γ
wyzwalające wolne rodniki.
Cyklodekstryny:

tworza

kompleksy

supramolekularne

z

enancjomerami,

różniące się stałymi trwałości. Zbudowane
są z jednostek d-glukozy, α-CD 6 jednostek,

β-7

jednostek,

γ-8

jednostek.

Są

hydrofobowe wewnątrz hydrofilowa na
zewnątrz. Ze względu na swoją chiralność
mogą rozpoznawać enancjomery.
Rozdzielanie

aminokwasów

i

ich

pochodnych aby rozdzielić związki chiralne
należy zastosować fazą stacjonarną, która też
ma charakter chiralny.
Grubość ma wpływ na właściwości retencji
kolumny 0,1 – 5 µm.
Warstwa

gruba-

czas

przenikania

i

wychodzenia dłuższy

rozmycie kolumny,

stosowana w przypadku analitów lotnych,
Cienka warstwa – anality o niższej lotności.
0,25 <d

c

<0,32mm to grubość l ≈ 0,25µm.

26.02.09

Zastosowania chromatografii gazowej:

Wyróżniamy dwie grupy zastosowań:

1)

rozdzielanie mieszanin substancji
lotnych

2)

oznaczanie jakościowe i ilościowe

Analiza ilościowa
- Zastosowanie chromatografii gazowej jako
kryterium czystości związków organicznych.
Wykonuje

się

chromatograf

gazowy-

nieobecność pików wskazuje na czystość
substancji.
- Potwierdzenie obecności lub nieobecności
związku pożądanego lub niepożądanego.

Współczynnik

selektywności

–

współczynnik

selektywności

α

miara

stosunku współczynnika podziału dwóch
substancji wymywanych jeden po drugim.
Jeden wybieramy jako standard to α może
być stosowane jako indeks.
Α=k

b

/k

a

k

b

-standard α- indeks dzięki

któremu identyfikujemy A.
Indeksy
log (t’

R

=t

R

-t

M

)

alkany:

z

I

df

10

=

; z- liczba atomów węgla w łańcuchu

alkanowym, dla innych związków:

2

1

2

'

log

'

log

'

log

'

log

100

100

2

R

R

R

Rx

T

t

t

t

t

z

I

−

−

+

=

+

Chromatografia adsorpcyjna gaz-ciało
stałe
Mechanizm: adsorpcja gazu na fazie
stacjonarnej – ciele stałym , jak GLC nie
działa to wtedy bierzemy tą bo adsorpcja jest
procesem gorzej ….niż……
Zastosowanie:

rozdzielanie

małych

cząsteczek, zanieczyszczenia powietrza, HS,
CS

2

, CO, CO

2

.

Kolumny: zarówno

upakowane jak i

kapilarne

(adsorbujące

ziarenko

przymocowane do ścianek kapilary.
Adsorbenty -
- sita molekularne
Najczęściej

są

to

glinokrzemiany

jonowymienne; od czego zależy wielkość
porów – im większy kation tym większe
pory, ziarno wypełniamy – wielkość sita
przez które zostało przesiane. Większy
numer

sita

tym

mniejsze

drobiny.

Porowatość mierzy się 4,5,10,13A°
Do CO stosuje się obejścia bo on się
adsorbuje nieodwracalnie.
- porowate polimery najczęściej na bazie
styrenu sieciowane diwinylobenzenem.

LC
Podstawą

klasyfikacji

jest

mechanizm

retencji:
Podział:

1)

podziałowa – cząsteczki o masie100
– 10 tyś o charakterze niejonowym
polarnym. Realizowana w fazach
normalnych i odwróconych : faza
stacjonarna –polarna faza ruchoma –
niepolarna układ normalny faza
ruchoma polarna faza stacjonarna
niepolarna- układ odwrócony.

2)

Mechanizm wymiany jonowej –
polarne

3)

Mechanizm adsorpcyjny – niepolarne

4)

Chromatografia

wykluczania

–

żelowa

przesiewania,

żelowa

przenikania.

Stosowane:
Wypełnienie hydrofobowe lub hydrofilowe
Cząsteczki o masie > 10

4

, chromatografia

faz odwróconych często stosowana w
wykluczania. Im mniejsza średnica ziarna
tym większa zdolność rozdzielcza

Przyczyny zagłady:

1)

wykrywalność

2)

adaptowalność

do

wykonywania

bardzo

dokładnych

oznaczeń

jakościowych

3)

odpowiedność,

dogodność

do

oznaczania substancji nielotnych i
termoniestabilnych.

Niskocząsteczkowe – gazowe
Mniej lotne – cieczowe.
Najczęściej rozdzielane i oznaczane amidy,
białka, kwasy nukleinowe, środki ochrony
roślin-pestycydy, związki metaloorganiczne
związki nieorganiczne.
Na sprawność kolumny w LC ma wpływ:
- Średnica ziarna wypełnienia
Im mniejsze ziarno tym wysokość półki H
mniejsza

większa sprawność.

- Pozakolumnowe poszerzanie pasm
Teoretyczny pik mamy do czynienia z
naturalnym rozmyciem piku na kolumnie w
wyniku chromatografowania.
RYSUNEK


Jeśli będziemy mieli podobne substancje
piki mogą się zlać.
Przyczyna powstawania:

o

od układu zastrzykującego (przyrząd,
sposób)

o

związane z detekcją

o

związane z układem przepływowym;
źródłem

jest

charakter/natura

przepływu im złączek więcej tym
poszerzenia więcej ; w oparach nie
bo mamy dyfuzję – dużo większe niż
aparaturowe rozmycie w cieczach.

;

24

2

3

n

D

u

r

Hex

=

im

↓

↑

tymH

D

M

- wielkość zastrzyku
Im zastrzyk mniejszy tym sprawność
większa.

Kolumny

faz

odwróconych

charakteryzują się najlepszą sprawnością.
Przyrządy: Kolumny o średnicy ziarna od 3-
10µm, jak mniejsze ziarno to kolumny 1 mm
jak większe ziarno to kolumny 445mm
rozdzielczość izokratyczna – 1 roztwór –
skład fazy ruchomej jest stały. Gradientowa-
skład fazy ruchomej zmienia się w trakcie
elucji.

Powietrze usuwamy na czole kolumny
buduje się bardzo wysokie ciśnienie atm. Na
kolumnie mamy ogromny gradient ciśnienia.
Rozpuszczalność gazów w cieczy rośnie ze
wzrostem ciśnienia za pomocą tlenowania.
2 doprowadzenie do wrzenia
3 podłączenie próżni
4 filtrowanie.
Układ pompujący w LC musi spełniać
wymagania :

1)

dostarczać ciśnienie rzędu 600 atm

2)

przepływ fazy ruchomej powinien
być bezpulsacyjny

3)

pompa powinna dostarczać roztwór
fazy ruchomej z prędkością 10µ L-
10mL

4)

Szybkość przepływu fazy ruchomej i
odtwarzalność przepływu powinna
być nie gorsza niż 0,5%.

5)

Odporność pompy na korozję

Pomimo ciśnień układy nie są niebezpieczne
z powodu ich wybuchowości.

Pompy:
-Pneumatyczne lub stałociśnieniowe
- wypierania (strzykawkowe)
- o tłoczkach poruszających się ruchem
posuwisto zwrotnym.
Zawór

obrotowy

szcześciopozycyjny

taksami jak w FIA tylko musi wytrzymywać
większe ciśnienia.
Próbki – na mikrokolumny ułamek 0,1 µ L
- analityczne 5-100 µ L
- półpraparatywne 1,2,3 mL

6.03.2009

Kolumny ogólne właściwości:
Długość [cm] 10-30 cm dawniej 1 m
Średnica

wewnętrzna:

preparatywna:

10mm-1m, analityczna pojedyncze mm
najczęściej 4 lub 1 mm, zależy od średnicy
ziarna preparatywny 10µm, analityczny
5,3µm. Typowe kolumny analityczne 4,6 µm
długość 25 cm. Zwykle charakteryzują się
od 40 do 60 tyś półek teoretycznych na metr
kolumny. Czas rozdzielania w sek, l = 4cm
śr = 4mm złoże 3µm. Zalety mikro średniej
kolumny:
- wysoka sprawność 100 tyś półek na metr
- niespotykana szybkość
- niewielkie zużycie rozpuszczalników.

Im wymagania czystości większe tym cena
wyższa.
Przedkolumny:
Między zaworem dozującym a kolumna jest
przedkolumna lub kolumna ochronna –
spełnia zadania:

1)

na niej osadzają się zaniczeszyczenia
stałe na przykład kurz który się
dostał.

2)

Na kolumnie mogą się wytrącać
osady

(gdy

stosujemy

różne

rozpuszczalniki do rozpuszczania
próbki, a inny do elucji) np. ACN
+HEX

może się wytrącić, my o

tym nie wiemy czy się coś wytrąciło
bo kolumny są stalowe służy przy
przepuszczaniu

większych

ilości

próbki.

3)

Zapobieganie krwawieniu kolumny
(faza stacjonarna w postaci cieczy na
nośniku agresywne fazy ruchome
względem fazy stacjonarnej będą ją
rozpuszczać i jej warstwa będzie
malała w czasie, przedkolumna
nasyca fazę stacjonarną eluentem (ta
sama faza stacjonarna).

Typy wypełnień z uwagi na porowatość:

1)

wypełnienia

porowate

ziarna

zbudowane z różnych materiałów;
szklane

kulki

na

powierzchni

warstwa cieczy

2)

nieporowate błonkowe, pelikularne
przedkolumna wypełniona złożem
pelikularnym

Materiały złóż porowatych :
- krzemionka
- żywice jonowymienne

Detektory:
W przeciwieństwie do GC nie ma ogólnego
detektora:
Wymagania takie jak w GC, oprócz:

1)

W GC detektor powinien wykazywać
czułość względem substancji w
szerokim zakresie temperatur tu nie
musi operować szerokim zakresem
temperatur

2)

Powinien

mieć

możliwie

małą

objętość detekcji.

Typy detektorów:
z

uwagi

na

właściwości

roztworu

przepływającego przez detektor i jego
odpowiedzi:
- Detektory które wykrywają zmianę
właściwości całego roztworu np. indeks
refrakcji, δ.
-

detektory

wykrywające

zmiany

charakterystyczne

tylko

dla

substancji

rozpuszczonych (zmiana fluorescencji, abs
UV)
LOD

próg

wykrywalności

(limit

of

detection).
Detektory absorpcyjne:
Najczęściej stosowane SA detek. Pracujące
w zakresie UV-ViS. Kuweta przepływowa
tor przepływa w kształcie Z – przy
minimalnej objętości własnej wprowadzenie
dłuższej drogi optycznej, jeśli przypadkowo
wejdzie pęcherz powietrza to już on
zostanie, dlatego często wprowadza się od
dołu;

okienka

kwarcowe.

Inne

w

analitycznej niż w preparatywnej. Droga
optyczna dłuższa w przypadku większego
rozcieńczenia

(analityczna).

W

preparatywnej – znaczna ilość próbki (mL)
dlatego droga optyczna jest krótsza. Pomiar
może być zaszumiany ze względu na fazę
ruchomą często faza ruchoma rozdzielany: w
jednym torze faza ruchoma w drugim torze
faza ruchoma z próbką . Detektor UV lampa
rtęciowa (najtańsza, 254 nm ) stosuje się
filtry dzięki którym można wydzielić inne
pasma. Stosując filtry można powiedzieć o
pewnym rodzaju selektywności. Oznaczanie
związków aromatycznych. Źródłem światła
lampa deuterowa lub włókno wolframowe
do tego filtry interferencyjne- wydzielanie
światła o danej długości fali.
Detektory spektrofotometryczne:
Dysponują monochromatorami (najczęściej
siatka dyfrakcyjna) UV-ViS-NIR 250-
1200nm możemy wybrać 1 długość fali
(oznaczanie przy konkretnej długości fali).
Służy

też

do

ilościowego

określania

analitów; możemy też zatrzymać przepływ,
aby zdjąć całe widmo, nadaje się do badania
czystości substancji. Przemiatanie widma
jest

stosunkowo

powolne,

należy

zatrzymywać przepływ, aby tego uniknąć

stosuje

się

detektory

matrycowe

–

rozdzielone w czasie. Zaletą detektora jest
wymiar szybkości oznaczeń. Wada aby
rozświetlić każdą z diód światło musi być
wyższe niż w spektrofotometrze może się
okazać że intensywność jest tak duża, że
rozkłada próbkę; dlatego powinno się
wykonywać

pomiar

przy

różnych

intensywnościach.
Detektor w IR mamy dwa typy

1)

Przemiatana długość fali, do tego
służą 3 kliny optyczne, zakres od 2,5
do 14,5 µm

2)

Detektor na IR z wykorzystaniem
transformaty Fouriera

Kuwety przepływowe – okienka nie mogą
być kwarcowe okienka z NaCl, CaCl, ale
faza ruchoma nie może być za wilgotna.
Długość drogi optycznej od 0,2 do 1mm
V det.kuwety 1,5-10µ L detektor może być
jedno lub 2 wiązkowy, można zatrzymywać
przepływ i zdejmować widmo.
Detektor z transformatą Fouriera – można
traktować

jako

analogi

detektorów

arejowych.

Ograniczenia

związane

z

rozpuszczalnikiem w fazie ruchomej ,
niektóre składniki nie przepuszczają IR np.
grupy karbonylowe. W fazie ruchomej nie
powinno być dwutlenku węgla, nie wolno
stosować rozpuszczalników z tymi grupami ;
OH nie można jako fazę ruchomą.

Detektor fluorescencyjny : taki sam jak do
badań fluorescencji, detektor pod kątem 90°
do

promieniowania

wzbudzającego,

najprostszy zbudowany ze źródła światła
(lampa XE, Hg) przestrajane lasery

podwyższa czułość i selektywność oznaczeń.
Zalety – wynikają z natury sp. Fluorescencji
– wysoka wykrywalność (rząd wielkości
większa

niż

w

absorbancji)

Wada:

ograniczenie do próbek które świecą. Świecą
materiały farmaceutyczne, naturalne próbki
ropy naftowej, związki aromatyczne; jeśli
nie

świeci

to

poddajemy

próbkę

przedkolumnowej modyfikacji

dodajemy

znacznik. Fluor – chlorek dansylu : chlorek
5-dimethyloamino -1-naftylo-sulfonylowy;
reaguje

z

aminami

II

rzędowymi,

aminokwasami,

fenolami,

w

wyniku

otrzymujemy związki o właściwościach
fluoryzujących.

Detektory ogólnego przeznaczenia:
- indeksu refrakcji RID
- rozpraszania światła przy odparowaniu
rozpuszczalnika ELSD

RID

CHROMATOGRAFIA GAZOWA ZE
SPEKTROMETRIĄ MAS (GC-MS)

Sposoby detekcji
- kwadrupolowy spektrometr masowy
- spektrometr masowy z transformatą
Fouriera
- detektor pułapkowania jonów (ITD)
(przystosowany do chromatografii gazowej)
zalety: niewielki (15 cm), niedrogi
2 tryby wyświetlania danych:
- wyświetlanie w czasie rzeczywistym
-

wyświetlanie

po

rekonstrukcji

komputerowej
Możemy wybrać wyświetlanie:
- wyświetlanie prądu pochodzącego z
jonizacji wszystkich składników
- wyświetlenie prądów tylko niektórych
substancji oznaczanych
- dla danego piku można wyświetlić widmo
masowe
Sprzężenie spektrometru masowego ze
spektrometrem mas.


Rys.1

Identyfikacji

dokonuje

się

porównując

widma masowe do tych, które znajdują się w
bibliotece.
Zastosowania:
- oznaczanie składu składników smakowych
i zapachowych produktów spożywczych.
- diagnoza medyczna stawiana w oparciu o
analizę wydychanego powietrza.
- oznaczanie składu metabolitu leków
-

identyfikacja

zanieczyszczeń

wód

naturalnych.

CHROMATOGRAFIA GAZOWA ZE
SPEKTROFOTOMETRIĄ

W

PODCZERWIENI (GC-FTIR)

Rurka świetlna

Rys.2

Rurka ma nie wprowadzać rozmycia pasu, a
światło podczerwone ma jak najintensywniej
oddziaływać

z

próbką.

Rurka

jest

ogrzewana.

Detektor radiacyjny (chłodzony ciekłym
azotem)

–

by

próbka

nie

ulegała

wykraplaniu.

KOLUMNY

STOSOWANE

W

CHROMATOGRAFII GAZOWEJ

1) Kapilarne
Wady pierwszych kolumn kapilarnych:
- niemożność zastrzykiwania dużych próbek
- kruche
- problemy związane z wprowadzeniem
próbki i połączeniem kolumny z detektorem.
- czas odtwarzalnego działania kolumny był
krótki
- zapychały się
- opatentowane
2) Upakowane (wypełnione całkowicie
jakimś materiałem)
Materiał kolumny:
- szkło
- metal
- stal nierdzewna
- miedź
- aluminium
- teflon
Długość: 2-3 m, zamknięte w zwój o
średnicy 15 cm.
Średnica wewnętrzna: 2-4 mm
Średnica ziarna: 150-250µm
Grubość warstwy stacjonarnej: 50nm-1µm
Bardzo ściśle upakowane, a złoże w nich
zawarte jest jednorodne.
Cechy idealnego wypełnienia:
- małe ziarno (150-250µm)
- jednorodne
- cząsteczki powinny być sferyczne
-

cząsteczki

powinny

być

odporne

mechanicznie
-

znaczna

powierzchnia

specyficzna

(przynajmniej 1m

2

/g)

- stabilne w podwyższonych temperaturach
- dobrze zwilżane przez fazę stacjonarną
Z czego wynika ograniczenie dotyczące
wielkości ziarna?
p≈1/d

2

więc jeżeli mamy jakieś ciśnienie, to

narzuca ono minimalną średnicę ziarna.
Typy kolumn:
WCOT- kolumna otwarta. Zbudowana ze
stali nierdzewnej, aluminium, plastiku,
potem szkło, wewnętrzna ściana jest

trawiona chemicznie (po to by faza
stacjonarna lepiej się trzymała)
SCOT

– Stały

nośnik

przylega

do

wewnętrznej ścianki.
Zaleta:

możliwość

zatrzymania

dużej

objętości fazy stacjonarnej.
Wada: Niższa sprawność niż WCOT.
FCOT – Kwarcowa, cienkościenna kapilara,
pokryta na zewnątrz poliimidem (dzięki
temu jest elastyczna). Kwarc musi być
pozbawiony

tlenków

metali,

aby

wyeliminować

adsorpcję.

Średnica

wewnętrzna:

250-320µm

(kapilary

o

średnicy 150-200 µm są trudne w użyciu, bo
są bardziej wymagające jeśli chodzi o
zastrzykiwanie próbek i sposoby detekcji).
Stosuje się czułe detektory o krótkim czasie
odpowiedzi i rozdzielacze.
Zalety: odporne, znacznie mniej reaktywne
względem

składników

zastrzykiwanej

próbki, elastyczne
Średnica wewnętrzna: > 500µm – kolumny
megabor.
Zaleta: można zastrzykiwać duże próbki
Wada: niska sprawność

FCOT

WCOT

SCOT

Upakowane

Odporność
chemiczna

Najlepsza

Najgorsza

Długość
(mm)

10-100

10-100

10-100

1-6

Wydajność
(półki/m)

2000-
4000

1000-
4000

600-
1200

500-1000

Rozmiar
próbki (ng)

10-75

10-1000

10-
1000

10-10

6

Szybkość
przepływu

Szybko

Szybko

Szybko

Wolno

Elastyczność

Tak

Nie

Nie

Nie

Sposoby

zapobiegania

adsorpcji

na

wypełnieniach i ścianach kolumn:
Adsorpcja wynika z oddziaływania z
polarnym podłożem (lub z polarnym
nośnikiem) – powodują to grupy siliniolowe.

Si

Si

Si

O

OH

O

OH

O

OH

O

Si

CH

3

Cl

CH

3

Cl

Si O

Si

CH

3

CH

3

Cl

ClH

+

+

Blokowanie powierzchni.

Faza stacjonarna:
Wymagania:

- niska lotność (temp wrzenia > o 100

o

C niż

temp wrzenia najmniej lotnego składnika
mieszaniny)
- trwałość termiczna
- odporność chemiczna
-

odpowiednia

charakterystyka

w

odniesieniu do współczynników retencji i
selektywności (dobrane do rozdzielanej
mieszaniny tek aby uzyskać optymalne
wartości k’ i α)
Jakie

rozpuszczalniki

spełniają

te

wymagania?
Faza stacjonarna powinna wykazywać różne
współczynniki

podziału

dla

różnych

składników rozdzielanej próbki. Różnice
współczynników podziału nie mogą być zbyt
duże, bo czas retencji będzie za długi.
Podstawą podziału faz stacjonarnych jest ich
polarność (najbardziej polarne grupy: -CN, -
CO, -OH; niepolarne: C

n

H

2n+1

). Podobne

rozpuszcza się w podobnym.
Od czego zależy kolejność wymywania?
Określana przez punkt wrzenia substancji
oznaczanej.
- polidimetylosiloksan (max temp 350

o

C) –

dla najniższej polarności.
- polifenylometylodimetylosiloksan (max
temp 350

o

C)

-

polifenylometylosiloksan

(max

temp

250

o

C)

- glikol polietylenowy (max temp 250

o

C) –

dla najbardziej polarnych.
Związane i usieciowane fazy stacjonarne.
Stosuje się je po to by podwyższyć trwałość
fazy stacjonarnej (zapobiega „krwawieniu”
kolumny). Jeżeli chcemy odmyć kolumnę z
zanieczyszczeń, a faza stacjonarna jest
związana lub usieciowana, to krwawienie
jest wyeliminowane.
Związane

–

chemiczne

wiązanie

monowarstwy na nośniku.
Sieciowanie – wykorzystuje się mechanizm
wolnorodnikowy (używa się nadtlenków).
Dodaje się je do ciekłej fazy stacjonarnej,
wtedy rodnik inicjuje reakcję polimeryzacji.
Produktem

takiego

sieciowania

jest

cząsteczka o dużej masie, a taką trudniej jest
wymyć z kolumny. Można też naświetlać
promieniami gamma co prowadzi do

powstawania wolnych rodników (dalej jak
wyżej)
Fazy chiralne
Zawierają centra asymetryczne. Służą do
rozdzielania enancjomerów.
2

sposoby

rozdzielania

związków

chiralnych:
- rozdzielane substancje modyfikuje się
chemicznie za pomocą reagenta czynnego
optycznie,

który

tworzy

parę

diastereoizomerów, które można rozdzielić
- zastosowanie fazy ciekłej chiralnej.
Kiedyś

rozdzielano

aminokwasami,

zawierającymi grupy siloksanowe połączone
wiązaniami aminowymi.
Obecnie stosuje się cyklodekstryny (od 6 do
12 członów d-glukozy, połączonych w
pierścień.

Wnętrz

pierścienia

–

hydrofobowe,

zewnętrzna

część

–

lipofilowa) Stosowane są do rozdzielania
związków optycznie czynnych.

18.04.08

Konstrukcja

detektora

elektrochemicznego

Rys.3

Jednoczesne

oznaczanie

siarczków

i

dwusiarczków – układ jak wyżej tylko z 2
elektrodami

i

obie

są

elektrodami

błonkowymi

rtęciowymi.

Elektrody

obmywana po kolei.
RSSR+2H

+

+2e

-

+Hg(nad strzałką)→2RSH

RSH+Hg→Hg(SR)

2

(S)+2H

+

+2e

-

Utleniane są siarczki z reakcji i te które były
w roztworze.
Obie elektrody obmywane jednocześnie-
można stosować do określania czystości
piku.

Można

jednocześnie

oznaczać

substancje utlenione i zredukowane (jedna
elektroda rtęciowa, druga z węgla szklistego
– pokrywają cały zakres potencjału)
DETEKTORY SPEKTROMETRII MAS.
Sposoby połączenia obu technik:
1) Stosowane są dzielniki przepływu. Z fazy
ruchomej wydzielana jest mała cześć, która
idzie do spektrometru masowego.
2) Zastosowanie poruszającego się pasa
transmisyjnego (np. drut na który kapie

wyciek z kolumny, drut przemieszcza się do
komory

gdzie

zostaje

odparowany

rozpuszczalnik, dalej przemieszcza się do
komory ze źródłem jonów co prowadzi do
jonizującej desorpcji)
3) Termospray – roztwór fazy ruchomej jest
odparowywany w trakcie przepływu przez
ogrzewaną, metalową kapilarę. Tworzy się
aerozol roztworu i analitu. Do fazy ruchomej
dodaje się octan amonu, który w wyniku
odparowywania jonizuje próbkę. Dobra
metoda

do

oznaczania

peptydów

i

nukleotydów.
Zalety:
-

bezpośrednie

wprowadzenie

do

spektrometru masowego całego roztworu
opuszczającego kolumnę (nie potrzeba
dzielnika)
- widma masowe są proste
- można od razu z widma otrzymać masę
oznaczanej substancji
Wady:
- termospray może być stosowany tylko dla
cząsteczek polarnych
- nieznana jest fragmentacja związku
4) Termiczne wytwarzanie mgły (aerozolu) i
jednoczesne usuwanie rozpuszczalnika. W
postaci gazowej pozostaje tylko analit.
Otrzymuje się widma powstałe w wyniku
chemicznej jonizacji próbki lub w wyniku
oddziaływania między elektronami.

RODZAJE

KOLUMN

W

CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ.
1) Chromatografia podziałowa
Stosuje

się

do

rozdziału

substancji

niejonowych

polarnych

o

masie

cząsteczkowej 1000-3000.
a) Ciecz-ciecz (ciecz na stałym nośniku,
adsorpcja)
Wady:
- faza stacjonarna jest wymywana
- faza stacjonarna nie nadaje się do elucji
gradientowej
b) Faz związanych (chemiczne związanie
cząsteczek)
Nośnikiem są ziarna jednorodne, porowate o
średnicy 3,5 lub 5µm. Są one odporne
mechanicznie. Powierzchnia ziarna to w
pełni

schydrolizowana

krzemionka

(hydrofilowa i polarna). Faza stacjonarna i
faza ruchoma różnią się polarnością.

Si O

CH

3

CH

3

Si R

R=C

8

, C

18

Fazy normalne
Polarność: A>B>C
Kolejność wymywania:
- niepolarna faza ruchoma:

- polarna faza ruchoma:

Fazy odwrócone
Polarność: A>B>C
Kolejność wymywania:
- polarna faza ruchoma:

- niepolarna faza ruchoma:

Wypełnienie kolumny faz normalnych:
- substancja związana z materiałem kolumny
ma charakter polarny.
Mechanizm

wymywania

w

fazach

związanych:
a) podziałowy
b) adsorpcji (opis retencji poprzez zjawiska
adsorpcji)
Zalety fazy związanej:
Faza stacjonarna C

18

może przyjąć więcej

analitu, czyli możemy zastrzykiwać większe
próbki.
Fazy odwrócone:
Faza ruchoma jest polarna.
Fazy normalne:
Stosuje się takie fazy stacjonarne jak łańcuch
alkilowy zakończony grupą: -nitrylową
(najmniejsza

polarność),

-diolową,

-

aminową, -dimetyloaminową (największa
polarność)
Rozpuszczalniki: eter etylowy, chloroform,
n-heksan.
Czas retencji jest tym dłuższy im dłuższy
jest łańcuch alkilowy fazy stacjonarnej (im
mniej polarna jest faza stacjonarna)

SPOSOBY

ROZDZIELANIA

ZA

POMOCĄ

CHROMATOGRAFII

PODZIAŁOWEJ.
Jak wybieramy kolumnę?
Kolumny

różnią

się

polarnością.

Polarnością

różnią

się

także

anality.

Najmniej

polarne

są

węglowodory<etery<estry<ketony<aldehydy
<Amidy<aminy<alkohole<woda.
Dobieranie

fazy

stacjonarnej

do

konkretnego rozdzielania.
Polarność fazy stacjonarnej powinna być
zgodna z polarnością analitu. Wtedy retencja
jest optymalna. Do wymywania stosuje się
fazę

ruchomą

o

polarności

znacznie

różniącej się.
Dobieranie fazy ruchomej do konkretnego
rozdzielania.
Bierzemy pod uwagę parametry (k’, N, α),
tak aby rozdzielanie było optymalne.
Jako pierwsze ustalamy k’, potem α. O k’
decyduje moc rozpuszczalnika. Miarą k’ jest
indeks polarności (P’) – wyznaczany przez
pomiar

rozpuszczalności

w

3

rozpuszczalnikach: dioksanie, nitrometanie,
etanolu. P’ jest ilościową miarą polarności.
P’

AB

= Ф

A

P’

A

+ Ф

B

P’

B

Ф

A

=V

A

\(V

A

+V

B

)

Ф

B

=V

B

\(V

A

+V

B

)

Zmiana P o dwie jednostki zmienia
współczynniki retencji o rząd wielkości.
Wpływ fazy ruchomej na selektywność
(α):
- optymalizacja współczynnika retencji (k’)
- zmienia się α tak by uzyskać zadowalające
rozdzielenie.

24.04.08

Fazy

ruchome

w

chromatografii

podziałowej:
- eter etylowy
- dichlorometan
- n-heksan
- chloroform
Wszystkie te fazy są niepolarne.

Modyfikacja

przedkolumnowa

(derywatyzacja przedkolumnowa)

Stosuje

się

np.

do

rozdzielania

aminokwasów. Używa się np. C

8

O

2

H

6

, który

tworzy fluorescencyjne izoindole.
Wykrywalność 10

-12

mola (pH).

W

chromatografii

podziałowej

niejednokrotnie wytwarza się pochodne
związków a dopiero potem się je rozdziela.
Robi się tak ponieważ:
- obniżenie polarności substancji
- niektóre substancje ciężko jest wykryć (bo
np. nie mają chromoforów, grup redoks)
- selektywne wzmocnienie sygnału detekcji.
Zalety:
- szybka, niewielka objętość próbki (µl)

CHROMATOGRAFIA

PAR

JONOWYCH.
Odmiana chromatografii podzialowej w
układzie faz odwróconych.
Stosowana jest do rozdzielania jonow. Jony
te są parowane za pomocą przeciwjonów
tak, że w roztworze utrzymywana jest
obojetna cząsteczka, która może być
rozdzielana na zwykły nosniku.
Stosuje się ją do rozdzielania chloranow i
azotanów, duzych jonów i surfaktantów
(wszystko to można rozdzielać także przy
pomocy chromatografii jonowej ale ta
technika jest mniej efektywna).
Najczęściej stosowane przeciwjony:
Aminy, kwasy karboksylowe i sulfonowe,
barwniki.
Rozdzielanie enecjomerów:
- Stosuje się chiralne fazy stacjonarne i
chromatografie

cieczową

bo

można

rozdzielić

enancjomery

na

skalę

preparatywną, im niższa jest temperatura
tym lepszy jest współczynnik podziału.
- Stosuje się cyklodekstryny które tworzą z
enancjomerami kompleksy o różnych stałych
trwałości.

CHROMATOGRAFIA ADSORPCYJNA.
Fazy stacjonarne:
- Krzemionka (SiO

2

) – bardzo polarna

- Aluminium (AlO

2

) – bardzo polarna

Mechanizm rozdzielania:
W skutek adsorpcji kolejność wymywania z
kolumy:

Olefiny

(najszybciej),

węglowodory

aromatyczne, halogenki i siarczki, etery,
nitrozwiązki, estry i ketony, alkohole,
aminy, sulfony, sulfotlenki, amidy, kwasy
karboksylowe (najwolniej)

Fazy ruchome są polarne.
Moc rozpuszczalnika (moc elucyjna)
Miara energii adsorpcji na jednostkę
powierzchni [J/m

2

]

Optymalizacja pomiarow.
Aby zoptymalizować pomiar trzeba wybrać
rozpuszczalnik

o

optymalnej

mocy

elucyjnej. Robi się to metodą prób i błędów.
Wybiera się rozpuszczalnik zbyt slaby i zbyt
mocny, a następnie miesza sieje w takim
stosunku aby uzyskać optimum rozdzielenia.
Mieszając rozpuszczalniki wplywamy na
współczynnik selektywności (α) tak aby k’
było stałe, przy czym k’ - musi być na tyle
duże aby rozdzielenie było możliwe.
Najpierw

badamy

na

chromatografii

cienkowarstwowej

a

dopiero

potem

wprowadzamy na kolumnę.
Zastosowanie chromatografii adsorpcyjnej:
- zw. niepolarne o masie cząsteczkowej <
5000.
Zalety:
- zdolnośc do różnicownia izomerów
geometrycznych

,

homologów,

konformerów.

CHROMATOGRAFIA JONOWA.
HPLC

wypelnione

wymieniaczami

jonowymi

(kolumna

anionitowa,

kationitowa).
Detekcja: mierzy się przewodnictwo.
Na kolumnę podaje się bufor (np. roztwór
kwasu) a potem zastrzykuje się probkę z
jonami.
Grupy funkyjne slużące do wymiany
jonowej:
- Kationity (wymieniają kationy): grupa
sulfonowa (-SO

3

-H

+

), kw. karboksylowe (-

COO-H

+

)

- Anionity (wymieniaja aniony): aminy (-
N(CH

3

)

3

-OH

-

).

Kationity: XRSO

3

-

H

+

+ M

x+

= (RSO

3

-

)

x

M

x+

+ MH

+

Anionity:

XRN(CH

3

)

3

+

OH

-

+

A

x-

=

[RH(CH

3

)

3

+

]

x

A

x-1

+ xOH

-

Stała wymiany K

ex

opisuje równowagi

jonowymienne.
K

ex

= {[ RSO

3

-

B

+

]s[H

+

]aq}/{[RSO

3

-

H

+

]s[B

+

]aq}

[ RSO

3

-

B

+

]s/[B

+

]aq = K

ex

*

{[RSO

3

-

H

+

]s/[H

+

]aq } = const

W roztworach wodnych stężenie jonow H

+

jest duzo większe niż w roztworach
rozdzielanych. Wymieniacz jonowy ma duże
stężenie miejsc jonowymiennych, dużo
większe niż stężenie jonów H

+

w roztworze.

Dlatego

przyjmujemy,

że

{[RSO

3

-

H

+

]s/[H

+

]aq } = const.

Jeżeli:
[RSO

3

-

H

+

]>>>[ RSO

3

-

B

+

]s

[H

+

]aq>>>[B

+

]aq, to:

[ RSO

3

-

B

+

]s/[B

+

]aq = K = C

S

/C

M

K = K

ex

+ const, C

S

- stężenie w fazie

stacjonarnej, C

M

- stężenie w fazie ruchomej.

K

ex

odpowiedzialna jest za powinowactwo

kationu do kationu oznaczanego względem
innego jonu. Jeżeli wartość K

ex

jest duża to

znaczy to, że kation w przeważającym czasie
elucji przebywa w fazie stacjonarnej, jęzeli
K

ex

jest małe tzn że kation w przeważającym

czasie elucji przebywa w fazie ruchomej.
Wartość

K

ex

rośnie

w

następującej

kolejności:
LI

+

<H

+

<NH

4

+

<K

+

<Rb

+

<Cs

+

<Ag

+

<Tl

+

<HO

2

+

<Mg

2+

<Zn

2+

<Co

2+

<Cu

2+

<Cd

2+

<Ni

2+

<Ca

2+

<

Sr

2+

<Pb

2+

<Ba

2+

<OH

-

<CH

3

COO

-

<HCOO

-

<Cl

-

<Br

-

<NO

3

-

<I-<C

2

O

4

2-

<SO

4

2-

Fazy stacjonarne:
Kiedyś stosowano żywice (kiepskie bo
anality wykazywały bardzo powolną dyfuzję
przez ziarno, pod wpłwem ciśnienia ziarna
zgniataly

się

i

zapychały

kolumnę).

Zastosowano

więc

złoża

pelikularne

(średnica 30-40µm, nieporowate, sferyczne,
pokryte warstwą zywicy jonowymiennej),
ale duże ziarna powodowały małą sprawność
kolumny. Obecnie stosuje się ziarna z
krzemionki

pokryte

materiałem

jonowymiennym (porowate, szybka dyfuzja)
o średnicy 3,5-10µl. Zastrzykiwana probka
musi bć niewielka.

Faza ruchoma:
- powinna rozpuszczać próbkę
- musi mieć taką moc elucyjną aby czasy
retencji były akceptowalne
- rozpuszczalnik musi oddzialywać z
substancją

rozpuszczoną

w

sposób

różnicujący.
Zastosowanie:
- w chemii nieorganicznej.

16.05.08

CHROMATOGRAFIA

W

STANIE

NADKRYTYCZNYM (SFC)
Połączenie

chromatografii

gazowej

i

cieczowej.
Cechy SFC:
- technika uzupełniająca w stosunku do GC i
LC.
- stosowana do rozdzielania substancji
nielotnych lub niestabilnych termicznie
- rozdzielanie substancji pozbawionych grup
funkcyjnych (1/4 związków)

Porównanie

płynów

nadkrytycznych

z

gazami i cieczmi:

Gaz

Ciecz
nadkrytyczna

Ciecz

Gęstość
[g/cm

3

]

(0,6-2)*10

-3

0,2-0,5

0,6-2

Współczynnik
dyfuzji
[cm

2

/s]

(1-3)*10

-1

10

-3

-10

-4

(0,2-2)*10

-5

Lepkość
[gcm

-1

s

-1

]

(1-3)*10

-3

(1-3)*10

-4

(0,2-3)*10

-2

Fazy ruchome w SFC:
- CO

2

(T

KR

= 31,3

o

C, p

KR

= 72,9 atm)

- N

2

O (T

KR

= 36,5

o

C, p

KR

= 71,7 atm)

- NH

3

(T

KR

= 132,5

o

C, p

KR

= 112,5 atm)

- n-butan (T

KR

= 152

o

C, p

KR

= 37,5 atm)

Zdolność

rozpuszczania

substancji

nielotnych o dużej masie cząsteczkowej.
- CO

2

rozpuszcza n-alkany (do 30 at. węgla),

di-n-alkiloftalany

(4-16

at.

węgla),

poliaromatyczne węglowodory.

Aparatura:

Wpływ różnych parametrów na rozdzielanie
w SFC:
- ciśnienie ma duzy wpływ na współczynnik
retencji (k’). Im wyższe jest ciśnienie, tym
większa jest gęstość fazy ruchomej, co
powoduje

zwiększenie

rozpuszczalności

analitów, a to oznacza, że czas elucji ulega
skroceniu (czyli, że k’ się zmniejsza). Np.
jeśli ciśnienie CO

2

rosnie od 70 do 90 atm,

to czas wymywania spada z 25 d0 5 minut.
Ciśnienie jest najważniejszym parametrem
optymalizującym pomiar.

Fazy stacjonarne w FSC:
Kolumny:
- otwarte (ściany- usieciowant silikon, dł –
10-20m, śr. wew. – 50-100µm)
- upakowane (śr. – 0,5-4,6mm, śr. ziarna – 3-
10µm)

Fazy ruchome:
- CO

2

Zalety CO

2

:

- dobry rozpuszczalnik wielu substancji
organicznych
- nie absorbuje UV (można stosować
detektor UV-vis)
- bezwonny, nietosyczny
- łatwo dostępny, tani
- niskie parametry krytyczne
Wady:
- absorbuje w podczerwieni
- koszty (droga aparatura ciśnieniowa)

Modyfikatory fazy ruchomej:
Do CO

2

dodaje się polarny metanol. Za

pomocą dodatków zmieniamy współczynnik
selektywności (α).

Detektory:

- płomieniowo-jonizacyjny (czuły na każdy
analit opuszczający kolumnę, pracuje w
sposób ciągły bez zaburzeń)
- detektor ze spektrometrii mas
- UV-vis
- spektrometrii w podczerwieni
- emisji fluorescencyjnej
- termojonowy
- płomieniowo-fotometryczny

Porównanie SFC z innymi odmianami
chromatografii kolumnowej:
- SFC jest szybsza niż LC (bo faza ruchoma
ma mniejszą lepkość)
- SFC- poszerzanie pików jest większe niż
w LC ale mniejsze niż w GC
- rozdzielanie W SFC jest szybsze niż w LC
- mniejsze rozmycie pasma niż w GC
-

liniowa

prędkość

przepływu

przy

optymalnych warunkach jest 4 razy większa
dla SFC niż dla HPLC (co oznacza 4 razy
krótszy czas retencji dla SFC)
- w SFC faza ruchoma nie tylko przenosi
anality, ale także odziaływuje z nimi przez
co wpływa na współczynnik selektywności
(α).
- zdolność rozpuszczania fazy nadkrytycznej
zależy od składu chemicznego i gęstości
cieczy w stanie nadkrytycznym
-

można

wpływać

na

współczynnik

selektywności

zmieniając

skład

fazy

ruchomej.

Stosowalność GC, LC, SFC w zależności od
masy cząsteczkowej:
GC – do około 10

3

[d]

LC – do około 10

6

[d]

SFC – do około 10

6

[d]

Zastosowania SFC:
Produkty

naturalne,

leki,

produkty

żywnościowe,

pestycydy

i

herbicydy,

surfaktanty,

polimery

i

dodatki

do

polimerów,

paliwa

kopalne,

materiały

wybuchowe, paliwa napędowe.

WYSOKOSPRAWNA
ELEKTROFOREZA KAPILARNA.
3 wady klasycznej elektroforezy:
- powolna

- wymaga ogromnych przygotowań
- bardzo słaba odtwarzalność

Zasada działania elektroforezy kapilarnej:
Rozdzielanie

naładowanych

substancji

rozpuszczonych w roztworze polarnego
rozpuszczalnika.

Wykorzystywana

jest

różnica szybkości migracji analitu w polu
elektrycznym.

Aparatura:

Zastrzykiwanie próbki
- hydrodynamiczne:

- elektrolityczne:

Zalety kapilar w porównaniu do bloku
żelowego:

- kapilara: średnica wewnętrzna – 25-30µm,
długość – 1m, objętość zastrzykiwanej
próbki – 1-10µl (zaleta!)
- dobrze odprowadzają ciepło Joula (bo duży
stosunek powierzchni do objętości)
- wysoki opór omowy (można stosować
bardzo silne pola elektryczne: 100-500V/cm)
- krótki czas analizy
- dużo większa rozdzielczość (sprawność
nawet do 10

5

półki teoretycznej)

Odmiany elektroforezy kapilarnej:
1) Kapilarna elektroforeza strefowa (CZE)
Kapilara wypełniona jest buforem, przepływ
elektroosmotyczny,

rozdzielenie

spowodowane

różnicą

ruchliwości

i

rozdzielają się na strefy.

Źle rozdziela substancje obojętne, bo
wszystkie są w jednej strefie.

Zastosowanie:
Równoczesne

rozdzielanie

kationów

i

anionow, ale musza się one różnić gęstością
ładunku.

Rozdzielanie

aminokwasów,

peptydów,

jonów

organicznych

i

nieorganicznych, enancjomerów. Badanie
czystości białek, konformerów.
Selektywność:
Zależy

od

mechanizmu

rozdzielania.

Najłatwiej zmienia się ją zmieniając pH
buforu lub dodając do buforu różne
substancje modyfikujące. Oba sposoby
wpływają na zmianę EOF (ale przepływ
elektroosmotyczny nie jest odpowiedzialny
za selektywność)

Czas migracji:
Zależy od gęstości ładunku jonów. Im
większy stosunek ładunku do promienia jonu
tym krótszy czas migracji.
µ

EOF

(anion) > µ

E

(anion) to aniony

poruszają sie w tą sama stronę co kationy,
tyle że wolniej. Jeśli wyeliminujemy EOF, to

kationy zaczną płynąc do katody, aniony do
anody, a substancje obojętne w ogóle się nie
ruszą.

2)

Micelarna

chromatografia

elektrokinetyczna (MEKC)
Jedyna odmiana elektroforezy kapilarnej za
pomocą której można rozdzielić substancje
naładowane i obojętne. Do buforu dodawany
jest detergent, substancje rozdzielają się w
skutek oddziaływan hydrofobowych.

Substancje do tworzenia miceli:
Anionowe: SDS
Kationowe: sole alkiloaminowe
Niejonowe: TRIS

k’ = n

mc

/n

s

– współczynnik retencji

k’ = (t

R

-t

0

)/[t

0

(1-t

p

/t

me

)] = K*V

S

/V

M

K- wsółczynnik podziału, V

S

– objętość fazy

miceli, V

M –

objętość fazy ruchomej.

Rozdzielczość:

mc

mc

MERC

S

t

t

t

t

k

k

N

R

0

0

1

1

'

1

'

1

4

+

−

+

−

=

α

α

'

1

'

1

4

k

k

N

R

LC

S

+

−

=

α

α

Kiedy R

S

MECK

dąży do R

S

LC

?

Gdy t

mc

dąży do α, wtedy ostatni człon w

R

S

MECK

znika.

Gdy t

0

/t

mc

dąży do 0 to R

S

MECK

dąży do

R

S,max

LC

.

Jak poprawić rozdzielczość?
- zwiększając ilość półek teoretycznych
- zwiększając selektywność
-

optymalizując

współczynnik

retencji

(zmieniamy go poprzez zmianę stężenia
substancji powierzchniowo czynnej. k’
wzrasta

wraz

ze

wzrostem

stężenia

surfaktantu. Im większe jest stężenie
surfaktantu, tym większe prądy płyną co
powoduje grzanie się układu – górne
ograniczenie stężenia surfaktantu, dolne –
stężenie krytyczne tworzenia się miceli)

Zastosowanie:
- rozdzielanie substancji obojętnych zarówno
hydrofobowych jak i hydrofilowych oraz
jonowych:

aminokwasy,

nukleotydy,

witaminy, węglowodory aromatyczne.

Aniony są rozdzielane z uwagi na ich
różnicę

ruchliwości

elektroforetycznej

(mniej naładowane poruszają się szybciej niż
te bardziej naładowane).

Rozdzielanie jonów:
- różnica ruchliwości elektroforetycznej
oznaczanych jonów
- oddziaływania Kulombowskie jonów i
jonów tworzących micele
- oddziaływania hydrofobowe w micelach

Substancje modyfikujące bufory:
Bufory modyfikujemy ponieważ chcemy
zmienić

ładunek

miceli

lub

ładunek

cząsteczki oznaczanej.
Np. - dodatek soli tetrabutyloamoniowej do
SDS podwyższa rozpuszczalność kwasów
karboksylowych przez co podwyższa się
stężenie miceli.
- dodatek kationów Zn

2+

lub Cu

2+

do buforu

w którym mamy ujemnie naładowane micele
powoduje

tworzenie

kompleksów

na

powierzchni miceli
- tworzenie drugiej pseudofazy: dodatek
cyklodekstryn pozwala rozdzielać substancje
bardzo

hydrofobowe.

Cyklodekstryny

poruszają się z prędkością EOF (bo są
obojętne, kation znajduje się w środku)
- dodatek rozpuszczalnika organicznego –
zmienia przepływ EOF bo zmienia potencjał
elektrokinetyczny,

zmienia

także

selektywnośc, można wtedy zastosować
gradienty elucji.

3) Kapilarna elektroforeza żelowa (CGE)
Kapilarę

wypełnia

polimer.

Podstawą

rozdzielania

jest

wielkość

cząsteczki

substancji rozdzielanej (rozdzielanie oparte
na mechanizmie przesiewania jonowego).

Jest to elektroforeza strefowa. Najszybciej
poruszają się najmniejsze kationy. Przepływ
elektroosmotyczny jest wyeliminowany.
Zastosowanie:

rozdzielanie

protein,

sekwencjonowanie

DNA,

oznaczanie

fragmentów DNA.
Rozdzielczość: Zależy od procentowej
zawartości monomerów w polimerze:
2-6% - dobrze usieciowany
0,1-15% - liniowy
0,05-1,2% - agarowa
Sprawność kapilary: N≈10

6

-10

7

4) Kapilarne ogniskowanie izoelektryczne
(CIEF)
Bardzo wysoka rozdzielczość (∆pI =
0,005pH). Ścianki kapilary zabezpieczone są
tak, że przepływ elektroosmotyczny jest
wyeliminowany.

Wykorzystuje

się

właściwości analitów związane z różną
wartością

punktów

izoelektrycznych.

Kapilara

wypełniona

jest

buforem.

Stosowany jest gradient pH tworzony przy
pomocy amfolitów.

3<pH<9
pH

anolitu

<pI

min

pH

katolitu

>pI

max

Anolit (pH=3, np. 0,02M H

3

PO

4

) i katolit

(pH=9, np. 0,02M NaOH) są zawsze
różnymi elektrolitami.
Aby wytworzyć gradient pH stosujemy
amfolity (substancje o cechach kwasowych i
zasadowych, mogą to być albo kationy albo
aniony). Są one dobierane tak aby pokryć
cały zakres pH. Brak klasycznego zastrzyku,
tu od razu całą kapilarę wypełnia się
mieszaniną

wszystkiego.

Następnie

przykłada się napięcie co powoduje gradient
pH. Jony oznaczane płyną w to miejsce w
kapilarze gdzie mogą zostać zobojętnione.
Sygnałem końca analizy jest to, że przestaje
płynąć prąd. Możemy modyfikować ściany
kapilary poprzez dodatek detergentu, ale
wtedy ciężko jest uzyskać powtarzalność
wyników.

Kolejnym

etapem

jest

wymywanie roztworu z kapilary np. za
pomocą

różnicy

ciśnień

przepychamy

otrzymane strefy przez detektor. Jeżeli

kapilara jest z żelem to zastępujemy H

3

PO

4

NaOH i włączamy ponownie prąd.

Zastosowanie:
- rozdzielania białek
- nie dzielą się substancje obojętne i nie da
się oddzielić anionów od kationów, można
oddzielic tylko kationy od kationów, a
aniony od anionów.

Rozdzielczość:
Jest tym większa im większe jest pole
elektryczne, im mniejsze są zmiany pH w
kapilarze.
Przepływ elektroosmotyczny musi być
wyeliminowany.

Zalety:
- próbka może być duża
- można oznaczać bardzo rozcieńczone
roztwory
- jeśli kapilara wypełniona jest żelem to
proteiny nie agregują po osiągnięciu punktu
izoelektrycznego.


5)

Elektroforeza

kapilarna

stref

poruszających się z taką samą prędkością
(CITP)
Służy do rozdzielania jonów tego samego
znaku oraz do zagęszczania anionów lub
kationów.

Nie

można

jednoczeeśnie

rozdzielać kationów i anionów. Ruchliwość
jonów oznaczanych ma się zawierac miedzy
ruchliwością

buforu

czołowego

i

końcowego. W obrębie kazdej ze stref różne
jest natężenie pola elektrycznego. Granica
pomiędzy pasmami jest bardzo ostra. Pasma
poruszają się z tą samą prędkością. W każdej
ze stref stężenie jest stałe (stężenie analitu w
każdej ze stref = stężenie analitu buforu
czołowego). Przepływ elektroosmotyczny
jest wyeliminowany. Detekcja – UV-vis,
detektor termiczny. Zaleta: Nie trzeba
zmieniać kolumny tylko skład buforu.