P

IOTR

W

YCHOWAŃSKI

2

, J

OANNA

K

OLMAS

1

, E

MIL

K

ALINOWSKI

2

, D

ARIUSZ

K

RZYWICKI

2

,

P

AWEŁ

C

HOMICKI

2

, M

ARTA

G

ĄSIOROWSKA

1

, A

NDRZEJ

W

OJTOWICZ

2

, W

ACŁAW

K

OŁODZIEJSKI

1

Analiza porównawcza szkliwa i zębiny
ludzkich zębów prawidłowych oraz nadliczbowych
metodą mikrospektroskopii
w zakresie średniej podczerwieni

Comparative Analysis of Enamel and Dentin from Regular
and Supranumerary Human Teeth by Means
of the Middle−Range Infrared Microspectroscopy

1

Katedra i Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej, Wydział Farmaceutyczny AM w Warszawie

2

Zakład Chirurgii Stomatologicznej IS AM w Warszawie

Dent. Med. Probl. 2006, 43, 1, 53–57
ISSN 1644−387X

PRACE ORYGINALNE

Streszczenie

Wprowadzenie. Spektroskopię w podczerwieni od wielu lat wykorzystuje się do badań materiałów biologicznych.
W badaniach fazy stałej, oprócz tradycyjnej techniki transmisyjnej, można zastosować technikę odbiciową. Wid−
ma otrzymane techniką odbicia zwierciadlanego przypominają widma transmisyjne, wówczas gdy grubość próbki
jest równa długości promieniowania, które na nią pada. Otrzymane widma poddaje się transformacji matematycz−
nej, a w przypadku odbicia zwierciadlanego najczęściej stosuje się transformację Kramersa−Kroniga. Występo−
wanie zęba nadliczbowego jest zaliczane do zaburzeń dotyczących zwiększonej liczby zębów o nieprawidłowej
budowie. Anomalia ta jest uwarunkowana genetycznie.
Cel pracy. Porównanie widm tkanek twardych zębów prawidłowych i nadliczbowych zarejestrowanych techniką
odbiciową w średniej podczerwieni, a także ocena przydatności tej techniki do badania różnic w składzie chemicz−
nym tych tkanek.
Materiał i metody. Badano tkanki zmineralizowane (zębinę i szkliwo) zębów prawidłowych oraz nadliczbowych
metodą mikrospektroskopii w średniej podczerwieni. Zastosowano technikę odbicia zwierciadlanego. Zarejestro−
wane widma przypisano, a następnie analizowano pod kątem różnic w budowie chemicznej tych tkanek.
Wyniki. Wyniki przedstawiono w formie graficznej.
Wnioski. Mikrospektroskopia w zakresie średniej podczerwieni daje możliwość wiarygodnego analizowania tka−
nek twardych ze szlifów, bez niszczenia ich struktury (Dent. Med. Probl. 2006, 43, 1, 53–57).

Słowa kluczowe: mikrospektroskopia w podczerwieni, zęby prawidłowe, zęby nadliczbowe.

Abstract

Background. Spectroscopy in infrared has been used for study of biological materials for ages. In study in con−
stant phase, beside traditional transmission technique, the reflection technique may be used. Spectra received by
means of mirror−reflection resemble transmission spectra if width of the specimen is equal to wavelength incident
on it. Received spectra are submitted to transformation, in mirror−reflection the most common is Kramers−Kronig
transformation. Supernumerary teeth are disturbance concerning increased number of teeth of irregular building.
This anomaly is genetically conditioned.
Objectives. The comparison of spectra of regular and supernumerary teeth mineral tissues received by means of
the mirror−reflection middle−range infrared microspectroscopy, and evaluation this technique for study differences
of chemical constitution of these tissues.
Material and Methods. Mineralised tissues (enamel and dentin) from regular and supernumerary human teeth

© Copyright by Silesian Piasts University of Medicine in Wrocław
and Polish Stomatological Association

Praca zrealizowana w ramach tematu statutowego FW−23/N/2005.

Spektroskopię w podczerwieni od wielu lat

wykorzystuje się do badań materiałów biologicz−
nych, w tym do analizy tkanek wchodzących
w skład zęba. Stosowano ją w badaniach składu
chemicznego tkanek twardych, zarówno zdrowych
[1–6], jak i patologicznych [7–9] oraz śledzono pro−
cesy, jakim tkanki ulegają w ciągu życia [10, 11].

W badaniach w fazie stałej, oprócz tradycyjnej

techniki transmisyjnej, która wymaga przygoto−
wania materiału w postaci pastylek z bromkiem
potasu lub jego suspensji w Nujolu, można zasto−
sować technikę odbiciową. Jest to technika umoż−
liwiająca wykonanie eksperymentu bez zniszcze−
nia struktury badanego obiektu, np. tkanki. Jest
jednak rzadziej stosowana, ponieważ wymaga
dodatkowego, specjalnego oprzyrządowania.
W technice odbicia zwierciadlanego (specular re−
flectance) próbkę umieszcza się na powierzchni
odbijającej promieniowanie podczerwone (np.
płytce ze złota). Możliwe są wtedy dwie drogi
optyczne: pierwsza, gdy promieniowanie po dotar−
ciu do próbki odbija się od niej i dzięki systemowi
zwierciadeł trafia do detektora, druga, gdy promie−
niowanie pada na próbkę, przechodzi przez nią
i odbija się na złotej płytce, następnie przechodzi
z powrotem przez próbkę i w końcu trafia do de−
tektora. Jakość widm rejestrowanych techniką
odbiciową silnie zależy od rodzaju powierzchni
próbki, grubości warstwy i jej transparencji dla
promieniowania podczerwonego. W szczególno−
ści w przypadku próbki proszkowej liczy się wiel−
kość ziaren (kryształów), a w przypadku materiału
w większych kawałkach duży wpływ na widmo
ma faktura jego powierzchni. Technikę odbiciową
stosuje się między innymi w pomiarach wykony−
wanych mikroskopem IR (mikrospektroskopia IR),
który jest w stanie zarejestrować widma z bardzo
małych pikseli o wymiarach rzędu 0,1 mm. Moż−
liwe jest również „mapowanie” powierzchni
próbek.

Ze względu na złożoność zjawisk absorpcji

i odbicia promieniowania IR widma odbiciowe
różnią się od typowych widm otrzymanych techni−
ką transmisyjną. Różnice te nie dotyczą położenia
pasm, lecz ich kształtu i względnej intensywności.
Przykładowo pasma mogą być odwrócone, gdy
dochodzi do całkowitej absorpcji promieniowania
przez badaną próbkę. Widma otrzymane techniką

odbicia zwierciadlanego przypominają widma
transmisyjne, wówczas gdy grubość próbki jest
równa długości promieniowania, które na nią pa−
da. W innych przypadkach, aby „sprowadzić”
otrzymane widmo odbiciowe do postaci widma
transmisyjnego poddaje się je odpowiedniej trans−
formacji matematycznej, wykonywanej przez
komputer kontrolujący spektrometr IR. W przy−
padku odbicia zwierciadlanego najczęściej stosuje
się transformację Kramersa−Kroniga.

Występowanie zęba nadliczbowego zalicza się

do zaburzeń dotyczących zwiększonej liczby zę−
bów o nieprawidłowej budowie. Anomalia ta po−
wstaje w wyniku zwiększonej aktywności listewki
zębowej i jest uwarunkowana genetycznie. Zęby
nadliczbowe częściej można zaobserwować
w uzębieniu stałym, szczególnie w szczęce i głów−
nie u mężczyzn. Wada ta występuje bardzo często
symetrycznie. Zęby te najczęściej spotyka się
w okolicy zębów siecznych w szczęce, drugich
przedtrzonowców w żuchwie i szczęce oraz zębów
trzonowych. W okolicy zębów trzonowych wyróż−
nia się dwa rodzaje zębów nadliczbowych – zęby
zatrzonowcowe występujące w postaci szczątko−
wej za trzecim zębem trzonowym najczęściej
w szczęce oraz zęby przytrzonowcowe zlokalizo−
wane policzkowo między pierwszym a drugim,
lub drugim a trzecim zębem trzonowym [12, 13].
Anomalia ta towarzyszy często niektórym zespo−
łom chorobowym uwarunkowanym genetycznie,
jak np. zespół Gardnera, zespół Leoparda, zespół
Hallermanna−Streiffa, dysostosis cleidocranialis,
w rozszczepkach warg i podniebienia. Jedną z cha−
rakterystycznych postaci tej wady jest mezjodens,
czyli ząb środkowy nadliczbowy [13].

Celem pracy było porównanie widm tkanek

twardych zębów prawidłowych i nadliczbowych
zarejestrowanych techniką odbiciową w średniej
podczerwieni, a także ocena przydatności tej tech−
niki do badania różnic w składzie chemicznym
tych tkanek.

Materiał i metody

Materiał do badań stanowiły tkanki twarde

(szkliwo oraz zębina) ludzkich, zdrowych zębów
prawidłowych i nadliczbowych, usuniętych ze

P. W

YCHOWAŃSKI

et al.

54

have been studied by means of the middle−range infrared microspectroscopy. Specular reflection mode has been
used. Recorded spectra have been assigned and then analysed with respect to chemical composition of the tissues.
Results. Results were showed in pictures.
Conclusions. The middle−range infrared microspectroscopy appears to be a valuable method for the analysis of the
tooth hard tissues received from specimen, without destroying their structure (Dent. Med. Probl. 2006, 43, 1, 53–57).

Key words: infrared microspectroscopy, regular teeth, supernumerary teeth.

wskazań ortodontycznych. Pobrano dwanaście zę−
bów przedtrzonowych prawidłowych szczęki
i dziesięć zębów nadliczbowych z przedniego od−
cinka szczęki. Następnie, za pomocą wierteł i se−
paratorów diamentowych, wykonano szlify o gru−
bości około 1–2 mm. Tak przygotowany materiał
badano techniką odbiciową w zakresie 4000–700
cm

–1

za pomocą aparatury firmy Perkin Elmer,

z użyciem mikroskopu AutoImage sprzężonego ze
spektrometrem Spectrum 1000.

System AutoImage umożliwia najpierw wy−

bór zakresu widzialnego (podgląd próbki), a na−
stępnie rejestrację widma IR. Każdą z próbek
umieszczano na powierzchni złotej płytki. Mikro−
skop jest wyposażony w kamerę, dzięki której
można obserwować próbkę w świetle widzialnym
na monitorze komputera. W ten sposób wybierano
odpowiedni obszar, z którego następnie zbierano
widmo. Z każdego szlifu zęba wykonywano trzy
pomiary w obszarze szkliwa oraz trzy w obszarze
zębiny, wybierając przy tym miejsca różnie odda−
lone od granicy szkliwno−zębinowej. Pomiary
każdorazowo przeprowadzano przy szerokości
szczeliny 100 µm/100 µm, stosując 1000 przebie−
gów (skanów) i automatycznie odejmując uprzed−
nio zarejestrowane tło. Każde widmo poddawano
transformacji Kramersa−Kroniga i przedstawiano
jako zależność absorbancji od liczby falowej.

Wyniki

Ryciny 1 i 2 przedstawiają wybrane, reprezen−

tatywne widma szkliwa i zębiny zębów prawidło−
wych i nadliczbowych zarejestrowane w zakresie
średniej podczerwieni, a następnie poddane trans−
formacji Kramersa−Kroniga. Rycina 1 przedstawia
widma szkliwa zęba nadliczbowego i prawidłowe−
go. Rycina 2 przedstawia widma zębiny zęba pra−
widłowego i nadliczbowego.

Omówienie

Pasma fosforanów w zakresie 1200–1000 cm

–1

są najlepiej rozdzielone dla szkliwa zęba prawidło−
wego (ryc. 1). Występują dwa, wyraźnie zaznaczo−
ne pasma przy około 1095 i 1070 cm

–1

, przy czym

pierwsze jest zdecydowanie wyższe. W widmie
szkliwa zęba nadliczbowego pasma te są nieco
przesunięte, gdyż występują odpowiednio przy
około 1110 i 1075 cm

–1

. Ich gorsze rozdzielenie mo−

że świadczyć o mniejszej krystaliczności apatytu
frakcji mineralnej szkliwa zębów nadliczbowych.

Pasma grup fosforanowych (1200–1000 cm

–1

)

zębiny zęba prawidłowego i nadliczbowego są
znacznie gorzej rozdzielone niż widma szkliwa

tych zębów (ryc. 1 i 2). Świadczy to o większej
krystaliczności szkliwa obu rodzajów badanych
zębów. Dla zębiny zęba prawidłowego (ryc. 2)
bardziej intensywne jest pasmo fosforanowe o niż−
szej częstości (1060 cm

–1

), pasmo o wyższej czę−

stości (około 1100 cm

–1

) przejawia się jedynie ja−

ko poszerzenie jego lewego zbocza. W przypadku
widma zębiny zęba nadliczbowego jest analogicz−
nie, ale rozdzielenie tych pasm jest jeszcze gorsze.
Można więc przypuszczać, że zębina zębów nad−

Analiza porównawcza szkliwa i zębiny ludzkich zębów prawidłowych oraz nadliczbowych

55

Ryc. 1. Widma szkliwa zęba prawidłowego oraz nad−
liczbowego wykonane techniką odbiciową w średniej
podczerwieni. Widma poddano transformacji Kramer−
sa−Kroniga w zakresie 4000–400 cm

–1

Fig. 1. Reflection infrared spectra of enamel from re−
gular and supranumerary teeth. The spectra were ob−
tained by Kramers−Kronig transformation

2000

1800

1600

1400

1200

1000

800

600

400

liczba falowa cm

–1

wave number

szkliwo zęba prawidłowego
enamel of regular tooth

szkliwo zęba nadliczbowego
enamel of supernumerary tooth

Ryc. 2. Widma zębiny zęba prawidłowego oraz nad−
liczbowego wykonane techniką odbiciową w średniej
podczerwieni. Widma poddano transformacji Kramer−
sa−Kroniga w zakresie 4000–400 cm

–1

Fig. 2. Reflection infrared spectra of dentin from regu−
lar and supranumerary teeth. The spectra were obtai−
ned by Kramers−Kronig transformation

2000

1800

1600

1400

1200

1000

800

600

400

liczba falowa cm

–1

wave number

zębina zęba prawidłowego
dentin of regular tooth

zębina zęba nadliczbowego
dentin of supernumerary tooth

liczbowych zawiera minerał o mniejszej krysta−
liczności niż zębina zębów prawidłowych.

Nie jest łatwa interpretacja pasma pojawiają−

cego się we wszystkich badanych tkankach przy
około 1230 cm

–1

. Dla tkanek zębów nadliczbo−

wych ma ono mniejszą intensywność względną
niż dla tkanek zębów prawidłowych. Znacznie
wyższe jest w zębinie niż w szkliwie. Wobec tego
można by je interpretować jako pasmo macierzy
organicznej (pasmo amidowe III), której zębina
zawiera znacznie więcej niż szkliwo. W szkliwie
jednak nie ma innych pasm amidowych (pasmo
amidowe I w zakresie 1680–1630 cm

–1

oraz pasmo

amidowe II w zakresie 1570–1515 cm

–1

), których

intensywność względem pasma amidowego III po−
winna być większa.

Na podstawie położenia, przez porównanie

z widmem bruszytu CaHPO

4

· H

2

O, pasmo 1230 cm

–1

można by także przypisać grupom wodorofosfora−
nowym HPO

4

2–

. Inne pasmo, które mogłoby po−

twierdzić obecność kwaśnych grup fosforanowych
powinno pojawić się przy około 870 cm

–1

. W przy−

padku szkliwa i zębiny interpretacja tego pasma nie
jest jednak jednoznaczna, gdyż w tym samym ob−
szarze występują także pasma jonów węglanowych
z sieci apatytu. Następną z możliwości jest przypi−
sanie pasma 1230 cm

–1

drganiom grupy > P =

O występującej na granicy frakcji organicznej i mi−
neralnej [14]. Grupa taka może być „wolna” lub
brać udział w wiązaniach wodorowych.

Interesujące wydaje się również pasmo przy

około 1650 cm

–1

. Jest ono znacznie większe w wid−

mie zębiny (ryc. 2) niż szkliwa (ryc. 1), gdzie za−
równo dla zęba prawidłowego, jak i nadliczbowego
występuje w postaci szczątkowej. Można przypisać
je drganiom molekuł wody, co byłoby zgodne z da−
nymi literaturowymi o większej zawartości wody
w zębinie (około 10%) niż w szkliwie (< 2%). Pa−
smo to mogłoby również pochodzić od macierzy
organicznej (wcześniej wspomniane pasmo amido−
we I), zaskakujący jest jednak wówczas brak inten−
sywnego pasma przy około 1740 cm

–1

(pasmo

drgań grupy karbonylowej C = O) występującego
na przykład dla tkanki kostnej [14]. Należy również
zauważyć brak pasma drgań libracyjnych molekuł
wody przy około 630 cm

–1

we wszystkich widmach.

Z powyższej dyskusji wynika, że przypisanie

pasm 1230 i 1650 cm

–1

pozostaje na razie nieroz−

strzygnięte.

W widmach tkanek zębów prawidłowych i nad−

liczbowych są obecne pasma pochodzące od grup
węglanowych z frakcji nieorganicznej. Grupy wę−
glanowe mają zdolność wbudowywania się w sieć
krystaliczną apatytów w dwojaki sposób. Mogą
podstawiać strukturalne grupy hydroksylowe hy−
droksyapatytu (węglany typu A) lub grupy fosfora−
nowe w sieci krystalicznej (węglany typu B).
W spektroskopii w podczerwieni jest możliwe roz−

różnienie tych dwóch typów substytucji na podsta−
wie różnic w położeniach pasm grup węglanowych
(tab. 1). Z przedstawionych widm (ryc. 1 i 2) wyni−
ka, że w szkliwie oraz zębinie zębów prawidłowych
oraz nadliczbowych występują obydwa typy wę−
glanów. Pasma 1540 i 1420 cm

–1

zarejestrowanych

widm odpowiadają odpowiednio pasmom 1545
i 1412 cm

–1

z tabeli 1. Pasmo 1450 cm

–1

natomiast

nakłada się w opisanych widmach z pasmem
1465 cm

–1

, a pasmo 880 cm

–1

nakłada się z pa−

smem 873 cm

–1

. W widmach szkliwa pasma węgla−

nowe są wyraźnie mniej intensywne niż w widmach
zębiny. Porównując szkliwo zęba prawidłowego ze
szkliwem zęba nadliczbowego, można stwierdzić,
że raczej zawiera ono mniej grup węglanowych,
a względna intensywność pasm węglanów w tkan−
kach zębiny obu typów zębów jest zbliżona.

Biorąc pod uwagę budowę komórki elemen−

tarnej hydroksyapatytu można stwierdzić, że pod−
stawienie grupami węglanowymi grup hydroksy−
lowych i grup fosforanowych zaburza strukturę
krystaliczną apatytu. Minerał zębiny zawiera oko−
ło 2 razy więcej grup węglanowych niż minerał
szkliwa [15] i jest to jeden z powodów, dla których
apatyt zębiny ma gorszą krystaliczność.

Wnioski

Analiza widm IR wykazała, że minerał tkanek

zębów prawidłowych jest bardziej krystaliczny niż
minerał zębów nadliczbowych. Zarejestrowane
widma niezbicie dowodzą, że zawartość macierzy
organicznej jest dużo większa w zębinie niż w szkli−
wie. Apatyt obu rodzajów zębów zawiera grupy
węglanowe (zarówno typu A, jak i typu B), co
wpływa na pogorszenie jego krystaliczności. Przed−
stawione widma potwierdzają, że zębina zawiera
znacznie więcej jonów węglanowych niż szkliwo.

Metoda mikrospektroskopii w zakresie śred−

niej podczerwieni daje możliwość analizowania
twardych tkanek zęba z cienkich szlifów, a więc
bez konieczności separowania tkanek i niszczenia
ich struktury. Z tego względu planuje się dalsze
prace wykorzystujące zalety tej techniki i badanie
granic szkliwno−zębinowych.

P. W

YCHOWAŃSKI

et al.

56

Węglany typu A

Węglany typu B

(Carbonates type A)

(Carbonates type B)

cm

–1

cm

–1

v

1

1545

1465

v

4

1450

1412

v

6

880

873

Tabela 1. Typowe położenia pasm grup węglanowych
apatytów typu A i B w widmach transmisyjnych IR [1]

Table 1. Typical localizations of strands of carbonate
apatites type A and B in transmission strands IR [1]

Analiza porównawcza szkliwa i zębiny ludzkich zębów prawidłowych oraz nadliczbowych

57

Piśmiennictwo

[1] E

LLIOTT

J. C., H

OLOCOMB

D. W., Y

OUNG

R. A.: Infrared determination of the degree of substitution of hydroxyl

by carbonate ions in human dental enamel. Calcif. Tissue Int. 1985, 37, 372–375.

[2] F

EATHERSTONE

J. D. B., M

AYER

I., D

RIESSENS

F. C. M., V

ERBEECK

R. M. H., H

EIJLIGERS

H. J. M.: Synthetic apati−

tes containing Na, Mg and CO

3

and their comparison with tooth enamel mineral. Calcif. Tissue Int. 1983, 35,

169–171.

[3] G

REENE

E., T

AUCH

S., W

EBB

E., A

MARASIRIWARDENA

D.: Application of diffuse reflectance infrared Fourier trans−

form spectroscopy (DRIFTS) for the identification of potential diagenesis and crystallinity changes in teeth. Mi−
crochem. J. 2004, 76, 141–149.

[4] S

OWA

M. G., M

ANTSCH

H. H.: FT−IR Photoacoustic depth profiling spectroscopy of enamel. Calcif. Tissue Int.

1994, 54, 481–485.

[5] M

AGNE

D., P

ILET

P., W

EISS

P., D

ACULSI

G.: Fourier transform infrared microspectroscopic lnvestigation of the ma−

turation of nonstoichiometric apatites in mineralized tissues: a horse dentine study. Bone 2001, 29, 547–552.

[6] W

YCHOWAŃSKI

P., K

ALINOWSKI

E., K

OZIERADZKI

K., K

OLMAS

J., K

OŁODZIEJSKI

W., W

OJTOWICZ

A.: Analiza porów−

nawcza szkliwa, zębiny i cementu w zakresie średniej podczerwieni. Dent. Med. Prob. 2004, 41, 413–416.

[7] W

OLOŻIN

A. I., G

RJECZISZNIKOW

W. I.: Infrakrasnyje spektry dentina zubow czełowieka w normie i pri patologii.

Stomatologija 1987, 66, 5, 10–13.

[8] N

IKOLISHIN

A. K., K

ISLOVSKIJ

L. D.: Infrakrasnaja spektroskopia emali pri fljuorozie zubow. Stomatologija 1991,

70, 2, 24–26.

[9] G

RJECZISZNIKOW

W. I.: Charaktier i osobiennosti walientnych koliebanij funkcjonalnych grupp w organoczeskoj

strukturie dentina zubow w noermie i pri patologii. Stomatologija 1989, 68, 5, 10–13.

[10] D

I

R

ENZO

M., E

LLIS

T.H., S

ACHER

E., S

TANGEL

I.: A photoacoustic FTIRS study of the chemical modifications of

human dentin surfaces: Demineralization. Biomaterials 2001, 22, 787–792.

[11] D

I

R

ENZO

M., E

LLIS

T.H., S

ACHER

E., S

TANGEL

I.: A photoacoustic FTIRS study of the chemical modifications of

human dentin surfaces: deproteination. Biomaterials 2001, 22, 793–797.

[12] B

OHDANOWICZ

F.: Chirurgia stomatologiczna. PZWL, Warszawa 1977, 61.

[13] W

YCHOWAŃSKI

P., W

OJTOWICZ

A., S

TAWICKA

−W

YCHOWAŃSKA

R., R

OSZKOWSKI

W., K

ALINOWSKI

E.: Analiza mor−

fologiczna zębiny zębów nadliczbowych i dodatkowych. Nowa Stomat. 2004, 27, 1, 3–6.

[14] K

AFLAK

−H

ACHULSKA

A., K

OLODZIEJSKI

W.: Preliminary results on infrared microscopy of human bone. J. Mol.

Struc. 1999, 511, 217–221.

[15] P

ASTERIS

J. D., W

OPENKA

B.: Lack of OH in nanocrystalline apatite as a function of degree of atomic order: im−

plication for bone and biomaterials. Biomaterials 2004, 25, 229–238.

Adres do korespondencji:

Emil Kalinowski
Zakład Chirurgii Stomatologicznej IS AM
ul. Nowogrodzka 59 paw. XI
02−006 Warszawa
tel.: [phone]
e−mail: e−[e-mail]

Praca wpłynęła do Redakcji: 4.01.2006 r.
Po recenzji: 16.01.2006 r.
Zaakceptowano do druku: 27.02.2006 r.

Received: 4.01.2006
Revised: 16.01.2006
Accepted: 27.02.2006