1

ZAKŁAD BIOCHEMII

UMCS

BIOCHEMIA II

I rok II stopnia

Biochemia

ELEKTROFOREZA DNA W ŻELU AGAROZOWYM

Wstęp

Elektroforeza jest to proces rozdziału cząsteczek, obdarzonych ładunkiem, w polu elektrycznym.

Rozdział wynika z różnic w ładunku i masie cząsteczek, co powoduje ich niejednakową ruchliwość. Odbywa się

to w specjalnych aparatach, których schematyczna budowa wygląda następująco:

Elektroforeza w żelach agarozowych i poliakrylamidowych stała się kluczową techniką

wykorzystywaną do rozdziału, identyfikacji i oczyszczania cząsteczek DNA. Technika ta jest prosta, szybka w

wykonaniu i pozwala na rozdział cząsteczek DNA, które nie mogą być zróżnicowane na drodze innych procedur,

takich jak wirowanie w gradiencie stężeń. Ponadto, umiejscowienie fragmentów DNA w żelu może zostać

określone przez użycie niewielkich stężeń takich substancji jak bromek etydyny, który pozwala na wykrycie

nawet 20 pg podwójnej nici DNA w żelu agarozowym. Wizualizacja prążków odbywa się po naświetleniu żelu

światłem UV. W razie konieczności fragmenty DNA z żelu mogą być wycięte i użyte do dalszych analiz.

Żele poliakrylamidowe pozwalają na rozdział niewielkich fragmentów DNA (5-500 bp), użycie takiego

żelu pozwala na zróżnicowanie fragmentów DNA różniących się już o 1 bp w długości lub o jedynie 0,1% w

masie cząsteczkowej. Chociaż czas rozdziału jest 1 relatywnie szybki i pozwala na rozdział dużej ilości DNA, to

przygotowanie żelu poliakrylamidowego jest bardziej pracochłonne niż żelu agarozowego.

Żele agarozowe pozwalają na mniejsze zróżnicowanie cząstek DNA, jednakże możliwe jest

rozdzielanie fragmentów DNA od 50 do 20 000 bp. W zależności od wielkości rozdzielanych fragmentów używa

się żeli o różnym stężeniu procentowym agarozy, przy czym ogólna zasada jest taka, że im mniejsze fragmenty

DNA tym większe stężenie agarozy.

2

Celem ćwiczenia jest sprawdzenie czystości i jakości wyizolowanego DNA z włosa ludzkiego.

Wykonanie ćwiczenia:

1) Przygotować 1 % roztwór agarozy w buforze 1xTBE.

2) Rozpuścić we wrzącej łaźni wodnej.

3) Schłodzić do temp. ok. 60°C.

4) Wylać żel o wymaganym kształcie i grubości.

5) Żel po zastygnięciu zanurzyć w buforze 1xTBE.

6) Do próbek DNA dodać bufor próbkowy w propocji 5:1.

7) Nanieść obciążone próbki DNA w ilości 5 µl do studzienek.

8) Podłączyć kamerę do zasilacza.

9) Po zakończeniu rozdziału wybarwić żel w wodnym roztworze bromku etydyny (koniecznie używać

rękawiczek) przez 15 min.

10) Przepłukać żel wodą destylowaną.

11) Obejrzeć żel w świetle UV przy użyciu transluminatora

Zaliczenie ćwiczenia:

Przedstawić wybarwiony żel oraz opis ćwiczenia w zeszycie.

3

Odczynniki:



bufor 10xTBE (108 g TRIS, 55 g kwasu borowego, 40 ml 0,5M EDTA pH 8,0; uzupełnić do 1 litra

wodą destylowaną i wyjałowić)



1% agaroza w buforze 1xTBE



bufor próbkowy (0,25% błękit bromofenolowy, 40 % sacharozy w wodzie destylowanej)



bromek etydyny (1mg/ml)