64

www.postepybiochemii.pl

Sylwester Głowacki



Janusz Błasiak

Katedra Genetyki Molekularnej, Wydział

Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet

Łódzki, Łódź



Katedra Genetyki Molekularnej, Wydział

Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet

Łódzki, ul. Pomorska 141/143, 90-236 Łódź; e-

-mail [e-mail]

Artykuł otrzymano 16 listopada 2012 r.

Artykuł zaakceptowano 14 lutego 2013 r.

Słowa kluczowe: metylacja DNA, epigenety-

ka, 5-hydroksymetylocytozyna, regulacja eks-

presji genów

Wykaz skrótów: 5-caC — 5-karboksycytozyna;

5-fC — 5-formylcytozyna; 5-hmC — 5-hydro-

ksymetylocytozyna; 5-mC — 5-metylocytozy-

na

Rola 5-hydroksymetylocytozyny i białek Tet

w epigenetycznej regulacji ekspresji genów

STRESZCZENIE

M

etylacja DNA pełni ważną rolę w epigenetycznej regulacji ekspresji genów człowieka.

Przez długi czas było kwestią dyskusyjną, czy w komórkach ssaków istnieją mecha-

nizmy aktywnej demetylacji DNA. Niedawne odkrycie białek rodziny Tet, zdolnych prze-

kształcać 5-metylocytozynę w 5-hydroksymetylocytozynę, pozwoliło opisać szlak, w którym

dochodzi do aktywnej demetylacji DNA. Wyniki dalszych badań sugerują, że 5-hydroksy-

metylocytozyna jest nie tylko produktem przejściowym w procesie demetylacji DNA, ale

może także regulować profil epigenetyczny genomu człowieka.

WPROWADZENIE

Metylacja DNA jest jedną z najważniejszych modyfikacji epigenetycznych ge-

nomu człowieka. Nie zmienia ona sekwencji DNA, jest jednak zachowywana

w trakcie podziałów komórkowych. Substratem dla metylacji DNA są cytozy-

ny wchodzące w skład dinukleotydów CpG, których większość zgromadzona

jest w obrębie wysp CpG, charakterystycznych dla obszarów regulatorowych

genomów ssaków, a produktem 5-metylocytozyna (5-mC). Metylacja DNA w

promotorach genów może prowadzić do wyciszenia ich ekspresji [1]. Z kolei

utrata metylacji może prowadzić do hamowania wzrostu i apoptozy, zarówno w

komórkach prawidłowych jak i nowotworowych [2,3]. Metylacja DNA odgrywa

także ważną rolę w rozwoju embrionalnym, co potwierdzają wyniki badań

przeprowadzonych na myszach [4]. Metylacja DNA może być przeprowadzana

de novo przez metylotransferazy DNA DNMT3a i DNMT3b lub odtwarzać wzo-

rzec metylacji po replikacji przez metylazę DNMT1. Przez długi czas jedynym

powszechnie akceptowanym mechanizmem demetylacji DNA w komórkach

ssaków była pasywna demetylacja będąca skutkiem podziałów komórkowych,

prowadzących do rozrzedzania wzoru metylacji. Jednakże do demetylacji DNA

dochodzi także w komórkach nieprzechodzących cytokinez, w których nie za-

chodzi replikacja DNA [5]. Choć u roślin obserwuje się proces demetylacji po-

wodowany działaniem glikozylaz DNA, enzymy te wykazują znacznie słabszą

aktywność w stosunku do 5-mC ssaków [6].

5-hydroksymetylocytozyna (5-hmC), stosunkowo niedawno odkryta mody-

fikacja cytozyny, powstaje w reakcji enzymatycznej oksydacji 5-mC przepro-

wadzanej przez enzym Tet1 (ang. ten-eleven translocation 1) (Tab. 1) [7]. Dopro-

wadziło to do wysunięcia hipotezy, zgodnie z którą 5-hmC jest produktem po-

średnim reakcji prowadzących do usuwania metylocytozyny z DNA [8]. 5-mC

charakteryzuje się wysoką stabilnością chemiczną. Utlenienie tego związku

do 5-hmC usuwa grupę metylową, ale pozostawia egzocykliczny podstawnik

Tabela 1. Historia badań nad 5-hmC i białkami Tet.

Data

Wydarzenie

Piśmiennictwo

1952

identyfikacja 5-hmC w DNA bakteriofagów

[11]

1972

pierwsza praca opisująca wysoki poziom 5-hmC w

komórkach ssaków; brak niezależnego potwierdzenia

tych wyników doprowadził do zarzucenia

badań nad 5-hmC na wiele kolejnych lat

[12]

2003

wskazanie, że Tet1 jest składnikiem fuzyjnej

onkoproteiny w ostrej białaczce szpikowej

[13]

2009

wykrycie 5-hmC w komórkach Purkiniego i mózgu, oraz

wykazanie, że Tet1 dokonuje oksydacji 5-mC do 5-hmC

[7,14]

2010

zwrócono uwagę, że wyniki dotyczące bisulfidowania

powinny być zweryfikowane, gdyż 5-hmC zachowuje

się przy zastosowaniu tej techniki tak samo jak 5-mC

[14]

Postępy Biochemii 59 (1) 2013

65

w pozycji 5 [9]. Ponieważ jednak 5-hmC powstała z 5-mC,

blokuje ona wiązanie się z DNA enzymu DNTM1 i odtwa-

rzanie wzoru metylacji po replikacji DNA, przekształcenie

5-mC do 5-hmC może być traktowane jako zniesienie znacz-

nika epigenetycznego [9,10]. Dalsze badania z wykorzysta-

niem profilowania genomowego wykazały jednak, że roz-

kład 5-hmC odbiega od rozkładu 5-mC i 5-hmC znajduje się

w promotorach wielu genów, co sugeruje, że związek ten

funkcjonować może także jako samodzielny epigenetyczny

regulator ekspresji genów o funkcji odmiennej od 5-mC [8].

BIOGENEZA 5-hmC I ROLA BIAŁEK Tet

Białka z rodziny Tet zawierającej trzy paralogi to zależ-

ne od oksoglutaranów i żelaza dioksygenazy (Tab. 2) [16].

U myszy produkty wszystkich trzech genów mogą prze-

kształcać 5-mC w 5-hmC. Poziom metylacji DNA wzrasta w

wyniku wyciszenia aktywności genów Tet [17]. Co więcej,

enzymy te katalizować mogą także inne przemiany 5-mC w

5-formylcytozynę (5-fC) i 5-karboksycytozynę (5-caC), zaś

obie te pochodne wykryte zostały w DNA embrionalnych

komórek macierzystych (ESC) oraz w pełni zróżnicowa-

nych komórek myszy [18].

Białka Tet zawierają wśród swoich domen bogate w resz-

ty cysteiny rejony odpowiedzialne za wiązanie DNA. Tet1 i

Tet3 zawierają także dodatkowe domeny zawierające palce

cynkowe CXXC, podobne do domen wiążących DNA, wy-

stępujących w DNMT1. Z drugiej strony analiza genomu

wskazuje, że domena ta w przypadku genu Tet2 zachowa-

ła się jako osobne białko, którego gen został oddzielony od

oryginalnego genu Tet2 w wyniku inwersji chromosomowej

[16]. Nie wiadomo jeszcze, czy cechy strukturalne tej dome-

ny w Tet1 umożliwiają, czy wręcz przeciwnie, uniemożli-

wiają wiązanie się tego białka z DNA [19,20]. Wyniki badań

sugerują, że domena ta nie bierze udziału w wiązaniu DNA

i jest zbędna dla zachowania katalitycznej aktywności Tet1

in vivo [19]. Zasugerowano, że aktywne wiązanie się z DNA

poprzez domeny zawierające palce cynkowe może bloko-

wać dostęp metylotransferaz DNA i w ten sposób dodat-

kowo negatywnie modulować poziom metylacji DNA [20].

W Tet1 zidentyfikowano też unikalne, bogate w reszty cy-

steiny struktury podobne do występujących w białku AlkB,

gdzie funkcjonują jako domeny wiążące DNA [16]. Ponadto

w białkach Tet zidentyfikowano domeny mogące ulegać su-

moilacji, co wskazuje, że modyfikacja ta może być jednym

ze sposobów na regulację aktywności tych białek [16].

ROLA 5-hmC W METABOLIZMIE KOMóRKOWYM

5-hmC może funkcjonować jako produkt pośredni w

szlakach demetylacji DNA. W tym celu musi zostać pod-

dana dalszym przemianom, które doprowadzą do odtwo-

rzenia niezmetylowanej cytozyny w miejscu pierwotnie

występującej 5-mC (Ryc. 1). Jednym z możliwych szlaków

jest szlak deaminacji z wykorzystaniem aktywności deami-

nazy AID/APOBEC, na co wskazywałaby korelacja między

nadprodukcją AID/APOBEC a spadkiem stężenia 5-hmC

[5]. Jednoczesna nadprodukcja Tet1 i AID/APOBEC pro-

wadzi z kolei do akumulacji 5-hydroksymetylouracylu,

deaminowanej pochodnej 5-hmC, która usuwana jest przez

glikozylazę DNA uracylu 1 [5,21]. W szlaku tym mogą tak-

że brać udział białko MBD4, które wykazuje zdolność usu-

wania 5-hydroksyuracylu; oraz glikozylaza tyminy w DNA

(TDG), usuwająca tyminę z błędnego sparowania G:T [22].

TDG może też usuwać oksydacyjne pochodne 5-hmC takie

jak 5-fC i 5-caC [22]. Pochodne te mogą być też usuwane

w szlaku naprawy DNA przez wycinanie zasad azotowych

(BER), choć sugeruje się także, że ich przemiana zachodzić

może również na drodze deformylacji i dekarboksylacji

[8,23].

Dotychczas biologiczna rola 5-hmC była najdokładniej

badana w kontekście rozwoju osobniczego, w regulacji pro-

cesów krwiotwórczych, roli w funkcjonowaniu komórek

nerwowych oraz w nowotworach [8]. W warunkach in vi-

tro w kulturach komórek z nadprodukcją Tet1 stwierdzono

obniżoną ilość 5-mC i nieznacznie podwyższoną ilość nie-

zmetylowanej cytozyny [7]. W dojrzałych tkankach poziom

5-hmC jest zróżnicowany i zwiera się w przedziale 0,03-

0,69%, osiągając największe wartości w neuronach, w któ-

rych stanowi do około 0,7% wszystkich cytozyn. Poziom ten

jest niższy w rejonach hipokampa bogatych w komórki ma-

cierzyste [24]. Z drugiej strony, wyniki badań nad komór-

kami macierzystymi myszy sugerują, że wyciszenie genów

Tet1 i Tet2 wywołuje spadek aktywności genów związanych

z pluripotencją i wzrost poziomu metylacji ich promotorów.

Sugerowałoby to, że poziom hydroksymetylacji DNA spa-

da wraz z różnicowaniem się komórek [25]. Badano także

wpływ procesów metylacji i demetylacji DNA na liczbę ko-

pii mtDNA w komórkach różnych tkanek. Zaobserwowano

na przykład, że 5-hmC jest elementem systemów regulują-

cych syntezę kodowanej jądrowo polimerazy DNA γ, której

aktywność istotnie wpływa na liczbę kopii mtDNA [26].

Tabela 2. Charakterystyka ludzkich enzymów Tet. Dane pochodzą z bazy uniprot.org.

Cecha

Tet1

Tet2

Tet3

Długość (aminokwasy)

2136

2002

1660

Masa (Da)

235 309

223 811

179 350

Katalizowana reakcja

DNA 5mC + 2-oksoglutaran + O

2

→ DNA 5-hmC + bursztynian + CO

2

Kofaktor

1Fe

2+

na podjednostkę

Specyficzność tkankowa

syntezowany w sercach, płucach i

mózgu płodów, ale nie wykryty w

tych samych narządach u dorosłych;

wykryty w mięśniach szkieletowych,

grasicy i jajnikach dorosłych

syntezowany w wielu tkankach, szczególnie

mocna w komórkach hematopoetycznych, przy

czym najwyższa ekspresja obserwowana jest

w granulocytach; ekspresja w granulocytach

krwi obwodowej zredukowana u pacjentów

cierpiących na zespoły mielodysplastyczne

synteza w jelicie,

mięśniach i

limfocytach krwi

obwodowej

66

www.postepybiochemii.pl

Należy także zaznaczyć, że 5-hmC może działać jak in-

hibitor metylacji zachowawczej, hamując wiązanie się z

hemimetylowanymi sekwencjami enzymu DNMT1. 5-hmC

powstająca jako produkt oksydacji 5-mC przez reaktywne

formy tlenu, pośredniczy w ten sposób w akumulacji zabu-

rzeń profilu metylacji DNA indukowanych stresem oksyda-

cyjnym [27]. Oddziaływanie między IDH (dehydrogenaza

izocytrynianu) a Tet sugeruje istnienie relacji pomiędzy

stresem środowiskowym a hydroksymetylacją DNA. Za-

proponowano mechanizm, w którym stres oksydacyjny in-

dukuje aktywację SIRT3, które z kolei aktywuje IDH2. Wy-

tworzony przez IDH2 α-ketoglutaran aktywuje Tet, które

przetwarzają 5-mC do 5-hmC [28].

ROLA 5-hmC I BIAŁEK Tet W REGULOWANIU ROZWOJU

Aktywność Tet ma fundamentalne znaczenie dla pra-

widłowego rozwoju zarodkowego. Poszczególne enzymy

z rodziny Tet są aktywne na różnych etapach rozwoju i/

lub w różnych tkankach. Tet1 jest głównym enzymem ak-

tywnym w ESC, zaś wyciszenie jego aktywności na drodze

interferencji RNA jest pozytywnie skorelowane ze spad-

kiem zawartości 5-hmC w genomie tych komórek [7]. Tet3

osiąga najwyższą aktywność w oocytach i zygotach, gdzie

najprawdopodobniej uczestniczy w reprogramowaniu ge-

nomu ojcowskiego po zapłodnieniu. Proces ten powiązany

jest ze znacznym wzrostem poziomu 5-hmC i ustaje po osią-

gnięciu stadium dwukomórkowego [29]. Jak dotąd jednak

nie wykazano bezpośrednio enzymatycznej aktywności

Tet3 w katalizowaniu przemiany 5-mC w 5-hmC [8]. Nie-

mniej proces reprogramowania epigenetycznego w klono-

waniu reprodukcyjnym zwierząt wymaga aktywności Tet3

i jest analogiczny do reprogramowania ojcowskich projąder

po zapłodnieniu [30].

Drugim obok reprogramowania epigenetycznego proce-

sem związanym z rozwojem jest piętnowanie genetyczne,

czyli zjawisko specyficznego zachowania rodzicielskiego

wzoru metylacji w wybranych genach. Geny poddane pięt-

nowaniu muszą być zabezpieczone przed aktywną demety-

lacją przeprowadzaną przez białka Tet. Jeden z wykrytych

mechanizmów działa w oparciu o aktywność białka STEL-

LA. Mutanty z nieaktywną formą tego białka nie rozróż-

niają w trakcie pierwszych etapów rozwoju zarodkowego

genomu matczynego i ojcowskiego i dokonują aktywnej

demetylacji obu, w tym elementów retrotranspozonowych

zawartych w genomie matczynym. Prowadzi to do zaha-

mowania rozwoju zarodkowego na wczesnym etapie. Wy-

kazano, że specyficzna rekrutacja STELLA do sekwencji

Rycina 1. Rola 5-hydroksymetylocytozyny (5-hmC) w szlakach metylacji i demetylacji DNA. Metylacja DNA przeprowadzana jest przez metylotransferazy DNA(DNMT).

Powstała 5-metylocytozyna (5-mC) jest modyfikowana przez enzymy z rodziny TET do 5-hmC i jej dalszych pochodnych. 5-hmC może być deaminowana do 5-hydrok-

symetylouracylu (5-hmU), usuwanego następnie w szlaku naprawy DNA przez wycinanie zasad azotowych. C — cytozyna; 5-fC — 5-formylocytozyna; 5-caC — 5-kar-

boksycytozyna. Na podstawie [9], zmienione.

Postępy Biochemii 59 (1) 2013

67

poddanych piętnowaniu hamuje wiązanie białek Tet i w ten

sposób chroni je przed demetylacją [31].

Wyniki badań z zastosowaniem immunofluorescencji

sugerują, że 5-hmC znajduje się zazwyczaj w obszarach eu-

chromatyny, w tym z rejonami oddziałującymi z sekwen-

cjami wzmacniającymi (ang. enhancers) i wykazującymi

metylację H3K4me1 i H3K27ac [32]. Stwierdzono także, że

poziom 5-hmC w mysich embrionalnych komórkach macie-

rzystych jest podwyższony w regionach wiążących czynni-

ki transkrypcyjne związane z pluripotencjalnością, zaś wy-

ciszenie Tet1 i Tet2 skutkuje ich metylacją i hamowaniem

ekspresji [25,33]. Choć nie obniża to żywotności, myszy z

delecją Tet2 wykazują zmiany rozwojowe i tendencję do no-

wotworów krwi lub szpiku [34]. Jednym z mechanizmów

takiego działania może być osłabianie przez 5-hmC oddzia-

ływania z czynnikami wiążącymi metylowane DNA [35].

Jednakże obecność mutacji Tet1 w embrionalnych komór-

kach macierzystych myszy ma mniejszy wpływ na rozwój

zarodkowy [17,36]. Choć wyciszenie genów Tet wywołuje

hamowanie ekspresji szeregu genów, powoduje ono także

uaktywnienie innych, w tym będących obiektem działania

kompleksu represorowego Polycomb 2 [37]. Sugeruje to po-

dwójną rolę jaką może pełnić 5-hmC, zarówno aktywatora

i represora ekspresji genów. Wśród indukowanych genów

znajduje się szereg markerów różnicowania, w tym Cdx2,

Eomes, Gata4 i Gata6 [38].

ROLA 5-hmC I BIAŁEK Tet W HEMATOPOEZIE

I NOWOTWORZENIU

Mutacje Tet2 wpływające na jego aktywność katalitycz-

ną są częste u chorych na białaczki różnego typu, zaś ich

obecność jest skorelowana z obniżonym poziomem 5-hmC

[39]. Zauważono, że w komórkach niektórych białaczek do-

chodzi do obniżenia aktywności białek Tet i jednoczesnego

spadku poziomu metylacji DNA. Zaproponowano, iż może

to wynikać z zaburzenia mechanizmów regulujących mety-

lację DNA [39]. Sugeruje się, że mutacje Tet2 mogą odgrywać

rolę w regulacji aktywności komórek macierzystych krwi i

procesach ich różnicowania. Myszy z mutacją Tet2 zmienia-

jącą aktywność domeny katalitycznej charakteryzowały się

podwyższonym poziomem hematopoetycznych komórek

macierzystych krwi (HSC, ang. hematopoietic stem cells). W

testach transplantacyjnych, HSC z mutacją w Tet2 wykazały

selekcyjną przewagę nad prawidłowymi HSC [40]. Myszy z

obniżoną aktywnością Tet2 rozwijają się początkowo pra-

widłowo, lecz z czasem zaczynają zapadać na różne choro-

by układu krwiotwórczego, w tym obejmujące zaburzenia

różnicowania się komórek [37,41]. Myszy z ekspresją Tet2

zredukowaną o 80% umierają już po trzech dniach od naro-

dzin, zaś w ich wątrobach obserwuje się wysokie poziomu

komórek progenitorowych krwi [42]. Jedną z konsekwencji

utraty aktywności Tet2 jest wzrost potencjału komórek ma-

cierzystych do odnawiania się. Co więcej, właściwości takie

obserwuje się nawet w komórkach z wyłączoną tylko jedną

kopią Tet2 (Tet2

+/-

) [41]. Stwierdzono także oddziaływanie

między konstytutywnie aktywną onkogenną kinazą tyro-

zynową BCR/ABL a białkami Tet. Oddziaływanie to pro-

wadzi do umiejscowienia Tet w cytozolu i spadku poziomu

5-hmC w genomie. Oddziaływanie inhibitora BCR/ABL

imatynibu, z kinazą BCR/ABL reaktywuje Tet i przywraca

fizjologiczny poziom 5-hmC w DNA [43]. Na rolę białek Tet

w hematopoezie wskazują także oddziaływania z innymi

białkami. Mutacje w genach białek IDH1 i IDH2 występują

często u pacjentów cierpiących na ostrą białaczkę szpikową.

Produktem aktywności IDH jest α-ketoglutaran. Stwier-

dzono, że zmutowane warianty tych białek upośledzają

aktywność Tet2 i hamują różnicowanie się komórek w trak-

cie hematopoezy [44]. Zwrócono także uwagę na potencjał

diagnostyczny i prognostyczny utraty hydroksymetylacji w

rozwoju czerniaka. Proces ten związany jest z utratą aktyw-

ności dehydrogenazy 2 izocytrynianu oraz enzymów Tet. W

badaniach na zwierzętach stwierdzono, że wprowadzenie

aktywnych form Tet osłabia wzrost nowotworu i zwiększa

przeżywalność zwierząt doświadczalnych [45].

ROLA 5-hmC I BIAŁEK Tet W TKANKACH NERWOWYCH

Tkanki nerwowe były obiektem badań, które pozwoliły

zrekonstruować niektóre z hipotetycznych szlaków deme-

tylacji opisanych wcześniej. Jako komórki niedzielące się,

stały się kandydatem do poszukiwania szlaków aktywnej

demetylacji, ponieważ w zróżnicowanych neuronach nie

zachodzi pasywna demetylacja na drodze podziału ko-

mórkowego [5]. W przypadku badań nad tkanką nerwową

myszy stwierdzono, że poziom 5-hmC może rosnąć wraz

z rozwojem i różnicowaniem komórek macierzystych ukła-

du nerwowego u dorosłych myszy [46]. Z wynikami tymi

jest spójna korelacja stwierdzona między stopniem rozwo-

ju móżdżku u człowieka a poziomem akumulacji 5-hmC w

jego tkankach [47]. Jest to także zgodne ze stwierdzonymi

obniżonymi poziomami 5-hmC pozytywnie skorelowany-

mi z anaplazjami w guzach mózgu [48]. Pod tym względem

funkcja 5-hmC wydaje się być w komórkach mózgu inna

niż w komórkach macierzystych, gdzie zwykle różnicowa-

niu towarzyszy spadek ilości 5-hmC. Różnice dotyczą także

rozkładu 5-hmC, w komórkach nerwowych jest ona raczej

nieobecna w regionach promotorowych, występuje zaś czę-

ściej w regionach kodujących genów [49]. Zmiany w hy-

droksymetylacji mogą też odgrywać rolę w rozwoju chorób

neurologicznych. Stwierdzono zwiększoną częstość zmian

w hydroksymetylacji genów powiązanych z rozwojem au-

tyzmu [47]. Wykazano, że pewne formy autyzmu związane

są z mutacjami w genie białka MeCP2, które w warunkach

in vitro blokuje aktywnością Tet1 [9].

Jak się wydaje 5-hmC i enzymy z rodziny Tet uczestniczą

także w epigenetycznej regulacji ekspresji genów mitochon-

drialnych w tkankach mózgu [50]. Stwierdzono obecność

5-hmC w DNA mitochondrialnym, a także lokalizację bia-

łek Tet w mitochondriach. Zauważono także, że wpływ na

aktywność Tet i poziom 5-hmC może mieć proces starze-

nia [50]. W móżdżku myszy w szeregu genów dochodzi do

akumulacji 5-hmC w trakcie starzenia, przy czym geny te

są związane z takimi procesami jak podatność na hipoksję,

angiogeneza czy związane z wiekiem procesy neurodege-

neracyjne [9].

PODSUMOWANIE

Odkrycie aktywności TET pogłębiło naszą wiedzę na

temat demetylacji DNA, która jest jednym z istotnych me-

chanizmów kontroli aktywności genów na poziomie epi-

68

www.postepybiochemii.pl

genetycznym. W ostatnich kilku latach uzyskano szereg

wyników potwierdzających znaczenie hydroksymetylacji

w regulacji takich procesów jak rozwój i różnicowanie ko-

mórek macierzystych, procesy transformacji nowotworowej

czy procesy starzenia. Jednakże pełna rola 5-hmC pozostaje

do wyjaśnienia. Dalszych badań wymaga określenie różnic

między rolą 5-hmC w regulacji fizjologii komórek macierzy-

stych, a rolą w komórkach zróżnicowanych. Także szlaki

przekształceń 5-hmC prowadzące do odtworzenia niezme-

tylowanej cytozyny wymagają dalszych badań. Wstępne

wyniki wskazują także, że badania nad 5-hmC mogą do-

starczyć nowych informacji o genezie i rozwoju niektórych

chorób.

PIŚMIENNICTWO

1. Prokhortchouk E, Defossez P-A (2008) The cell biology of DNA meth-

ylation in mammals. Biochim Biophys Acta 1783: 2167-2173

2. Jackson-Grusby L, Beard C, Possemato R, Tudor M, Fambrough D,

Csankovszki G, Dausman J, Lee P, Wilson C, Lander E, Jaenisch R

(2001) Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis

and epigenetic deregulation. Nat Genet 27: 31-39

3. Chen T, Hevi S, Gay F, Tsujimoto N, He T, Zhang B, Ueda Y, Li E

(2007) Complete inactivation of DNMT1 leads to mitotic catastrophe

in human cancer cells. Nat Genet 39: 391-396

4. Takebayashi S-I, Tamura T, Matsuoka C, Okano M (2007) Major and

essential role for the DNA methylation mark in mouse embryogenesis

and stable association of DNMT1 with newly replicated regions. Mol

Cell Biol 27: 8243-8258

5. Guo JU, Su Y, Zhong C, Ming G-L, Song H (2011) Hydroxylation of

5-methylcytosine by TET1 promotes active DNA demethylation in the

adult brain. Cell 145: 423-434

6. Zhu J-K (2009) Active DNA demethylation mediated by DNA glyco-

sylases. Annu Rev Genet 43: 143-166

7. Tahiliani M, Koh KP, Shen Y, Pastor WA, Bandukwala H, Brudno Y,

Agarwal S, Iyer LM, Liu DR, Aravind L, Rao A (2009) Conversion of

5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by

MLL partner TET1. Science 324: 930-935

8. Branco MR, Ficz G, Reik W (2012) Uncovering the role of 5-hydroxy-

methylcytosine in the epigenome. Nat Rev Genet 13: 7-13

9. Kriukienė E, Liutkevičiūtė Z, Klimašauskas S (2012) 5-Hydroxymeth-

ylcytosine — the elusive epigenetic mark in mammalian DNA. Chem

Soc Rev 41: 6916-6930

10. Inoue A, Zhang Y (2011) Replication-dependent loss of 5-hydroxy-

methylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science 334: 194

11. Wyatt GR, Cohen SS (1952) A New Pyrimidine Base from Bacterio-

phage Nucleic Acids. Nature 170: 1072-1073

12. Penn NW, Suwalski R, O’Riley C, Bojanowski K, Yura R (1972) The

presence of 5-hydroxymethylcytosine in animal deoxyribonucleic

acid. Biochem J 126: 781-790

13. Lorsbach RB, Moore J, Mathew S, Raimondi SC, Mukatira ST, Down-

ing JR (2003) TET1, a member of a novel protein family, is fused to

MLL in acute myeloid leukemia containing the t(10;11)(q22;q23). Leu-

kemia 17: 637-641

14. Kriaucionis S, Heintz N (2009) The nuclear DNA base 5-hydroxymeth-

ylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science 324:

929-930

15. Jin S-G, Kadam S, Pfeifer GP (2010) Examination of the specificity of

DNA methylation profiling techniques towards 5-methylcytosine and

5-hydroxymethylcytosine. Nucleic Acids Res 38: e125

16. Iyer LM, Tahiliani M, Rao A, Aravind L (2009) Prediction of novel

families of enzymes involved in oxidative and other complex modifi-

cations of bases in nucleic acids. Cell Cycle 8: 1698-1710

17. Ito S, D’Alessio AC, Taranova OV, Hong K, Sowers LC, Zhang Y (2010)

Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal

and inner cell mass specification. Nature 466: 1129-1133

18. Ito S, Shen L, Dai Q, Wu SC, Collins LB, Swenberg JA, He C, Zhang Y

(2011) Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine

and 5-carboxylcytosine. Science 333: 1300-1303

19. Frauer C, Rottach A, Meilinger D, Bultmann S, Fellinger K, Hasenöder

S, Wang M, Qin W, Söding J, Spada F, Leonhardt H (2011) Differ-

ent binding properties and function of CXXC zinc finger domains in

Dnmt1 and Tet1. PLoS ONE 6: e16627

20. Xu Y, Wu F, Tan L, Kong L, Xiong L, Deng J, Barbera AJ, Zheng L,

Zhang H, Huang S, Min J, Nicholson T, Chen T, Xu G, Shi Y, Zhang

K, Shi YG (2011) Genome-wide regulation of 5hmC, 5mC, and gene

expression by Tet1 hydroxylase in mouse embryonic stem cells. Mol

Cell 42: 451-464

21. Cortellino S, Xu J, Sannai M, Moore R, Caretti E, Cigliano A, Le Coz M,

Devarajan K, Wessels A, Soprano D, Abramowitz LK, Bartolomei MS,

Rambow F, Bassi MR, Bruno T, Fanciulli M, Renner C, Klein-Szanto

AJ, Matsumoto Y, Kobi D, Davidson I, Alberti C, Larue L, Bellacosa A

(2011) Thymine DNA glycosylase is essential for active DNA demeth-

ylation by linked deamination-base excision repair. Cell 146: 67-79

22. Sjolund AB, Senejani AG, Sweasy JB (2012) MBD4 and TDG: Multifac-

eted DNA glycosylases with ever expanding biological roles. Mutat

Res. doi: 10.1016/j.mrfmmm.2012.11.001

23. Maiti A, Drohat AC (2011) Thymine DNA glycosylase can rapidly ex-

cise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: potential implications

for active demethylation of CpG sites. J Biol Chem 286: 35334-35338

24. Globisch D, Münzel M, Müller M, Michalakis S, Wagner M, Koch S,

Brückl T, Biel M, Carell T (2010) Tissue distribution of 5-hydroxymeth-

ylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS

ONE 5: e15367

25. Ficz G, Branco MR, Seisenberger S, Santos F, Krueger F, Hore TA,

Marques CJ, Andrews S, Reik W (2011) Dynamic regulation of 5-hy-

droxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation.

Nature 473: 398-402

26. Kelly RDW, Mahmud A, McKenzie M, Trounce IA, St John JC (2012)

Mitochondrial DNA copy number is regulated in a tissue specific man-

ner by DNA methylation of the nuclear-encoded DNA polymerase

gamma A. Nucleic Acids Res 40: 10124-10138

27. Valinluck V, Sowers LC (2007) Endogenous cytosine damage products

alter the site selectivity of human DNA maintenance methyltransfer-

ase DNMT1. Cancer Res 67: 946-950

28. Chia N, Wang L, Lu X, Senut M-C, Brenner C, Ruden DM (2011) Hy-

pothesis: environmental regulation of 5-hydroxymethylcytosine by

oxidative stress. Epigenetics 6: 853-856

29. Iqbal K, Jin S-G, Pfeifer GP, Szabó PE (2011) Reprogramming of the

paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation

of 5-methylcytosine. Proc Natl Acad Sci USA 108: 3642-3647

30. Gu T-P, Guo F, Yang H, Wu H-P, Xu G-F, Liu W, Xie Z-G, Shi L, He X,

Jin S, Iqbal K, Shi YG, Deng Z, Szabó PE, Pfeifer GP, Li J, Xu G-L (2011)

The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by

oocytes. Nature 477: 606-610

31. Messerschmidt DM (2012) Should I stay or should I go: protection and

maintenance of DNA methylation at imprinted genes. Epigenetics 7:

969-975

32. Szulwach KE, Li X, Li Y, Chun-Xiao Song C-X, Han JW, Kim SS, Nam-

buri S, Hermetz K, Kim JJ, Rudd MK, Yoon Y-S, Ren B, He C, Jin P

(2011) Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic land-

scape of human embryonic stem cells. PLoS Genet 7: e1002154

33. Wu H, D’Alessio AC, Ito S, Wang Z, Cui K, Zhao K, Sun YE, Zhang

Y (2011) Genome-wide analysis of 5-hydroxymethylcytosine distribu-

tion reveals its dual function in transcriptional regulation in mouse

embryonic stem cells. Genes Dev 25: 679-684

34. Li Z, Cai X, Cai C-L, Wang J, Zhang W, Petersen BE, Yang F-C, Xu

M (2011) Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoi-

etic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies.

Blood 118: 4509-4518

35. Valinluck V, Tsai H-H, Rogstad DK, Burdzy A, Bird A, Sowers LC

(2004) Oxidative damage to methyl-CpG sequences inhibits the bind-

ing of the methyl-CpG binding domain (MBD) of methyl-CpG binding

protein 2 (MeCP2). Nucleic Acids Res 32: 4100-4108

Postępy Biochemii 59 (1) 2013

69

36. Dawlaty MM, Ganz K, Powell BE, Hu Y-C, Markoulaki S, Cheng AW,

Gao Q, Kim J, Choi S-W, Page DC, Jaenisch R (2011) Tet1 is dispens-

able for maintaining pluripotency and its loss is compatible with em-

bryonic and postnatal development. Cell Stem Cell 9: 166-175

37. Quivoron C, Couronné L, Valle Della V, Lopez CK, Plo I, Wagner-Bal-

lon O, Cruzeiro MD, Delhommeau F, Arnulf B, Stern M-H, Godley L,

Opolon P, Tilly H, Solary E, Duffourd Y, Philippe Dessen, Merle-Beral

H, Nguyen-Khac F, Fontenay M, Vainchenker W, Bastard C, Mercher

T, Bernard OA (2011) TET2 inactivation results in pleiotropic hemato-

poietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human

lymphomagenesis. Cancer Cell 20: 25-38

38. Wu H, D’Alessio AC, Ito S, Xia K, Wang Z, Cui K, Zhao K, Sun YE,

Zhang Y (2011) Dual functions of Tet1 in transcriptional regulation in

mouse embryonic stem cells. Nature 473: 389-393

39. Ko M, Huang Y, Jankowska AM, Pape UJ, Tahiliani M, Bandukwa-

la HS, An J, Lamperti ED, Koh KP, Ganetzky R, Liu XS, Aravind L,

Agarwal S, Maciejewski JP, Rao A (2010) Impaired hydroxylation of

5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature 468:

839-843

40. Ko M, Bandukwala HS, An J, Lamperti ED, Thompson EC, Hastie R,

Tsangaratou A, Rajewsky K, Koralov SB, Rao A (2011) Ten-Eleven-

Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differen-

tiation of hematopoietic stem cells in mice. Proc Natl Acad Sci USA

108: 14566-14571

41. Moran-Crusio K, Reavie L, Shih A, Abdel-Wahab O, Ndiaye-Lobry D,

Lobry C, Figueroa ME, Vasanthakumar A, Patel J, Zhao X, Perna F,

Pandey S, Madzo J, Song C, Dai Q, He C, Ibrahim S, Beran M, Zavadil

J, D Nimer SD, Melnick A, Godley LA, Aifantis I, Levine RL (2011)

Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and

myeloid transformation. Cancer Cell 20: 11-24

42. Shide K, Kameda T, Shimoda H, Yamaji T, Abe H, Kamiunten A,

Sekine M, Hidaka T, Katayose K, Kubuki Y, Yamamoto S, Miike T,

Iwakiri H, Hasuike S, Nagata K, Marutsuka K, Iwama A, Matsuda T,

Kitanaka A, Shimoda K (2012) TET2 is essential for survival and hema-

topoietic stem cell homeostasis. Leukemia 26: 2216-2223

43. Mancini M, Veljkovic N, Leo E, Aluigi M, Borsi E, Galloni C, Iacobucci

I, Barbieri E, Santucci MA (2012) Cytoplasmatic compartmentalization

by Bcr-Abl promotes TET2 loss-of-function in chronic myeloid leuke-

mia. J Cell Biochem 113: 2765-2774

44. Figueroa ME, Abdel-Wahab O, Lu C, Ward PS, Patel J, Shih A, Li Y,

Bhagwat N, Vasanthakumar A, Fernandez HF, Tallman MS, Sun Z,

Wolniak K, Peeters JK, Liu W, Choe SE, Fantin VR, Paietta E, Löwen-

berg B, Licht JD, Godley LA, Delwel R, Valk PJM, Thompson CB,

Levine RL, Melnick A (2010) Leukemic IDH1 and IDH2 mutations

result in a hypermethylation phenotype, disrupt TET2 function, and

impair hematopoietic differentiation. Cancer Cell 18: 553-567

45. Lian CG, Xu Y, Ceol C, Wu F, Larson A, Dresser K, Xu W, Tan L, Hu

Y, Zhan Q, Lee C-W, Hu D, Lian BQ, Kleffel S, Yang Y, Neiswender J,

Khorasani AJ, Fang R, Lezcano C, Duncan LM, Scolyer RA, Thompson

JF, Kakavand H, Houvras Y, Zon LI, Mihm MC, Kaiser UB, Schatton

T, Woda BA, Murphy GF, Shi YG (2012) Loss of 5-hydroxymethylcyto-

sine is an epigenetic hallmark of melanoma. Cell 150: 1135-1146

46. Song C-X, Szulwach KE, Fu Y, Dai Q, Yi C, Li X, Li Y, Chen C-H, Zhang

W, Jian X, Wang J, Zhang L, Looney TJ, Zhang B, Godley LA, Hicks

LM, Lahn BT, Jin P, He C (2011) Selective chemical labeling reveals

the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Bio-

technol 29: 68-72

47. Wang T, Pan Q, Lin L, Szulwach KE, Song C-X, He C, Wu H, Warren

ST, Jin P, Duan R, Li X (2012) Genome-wide DNA hydroxymethyl-

ation changes are associated with neurodevelopmental genes in the

developing human cerebellum. Hum Mol Genet. doi: 10.1093/hmg/

dds394

48. Kraus TFJ, Globisch D, Wagner M, Eigenbrod S, Widmann D, Münzel

M, Müller M, Pfaffeneder T, Hackner B, Feiden W, Ulrich Schüller U,

Carell T, Kretzschmar HA (2012) Low values of 5-hydroxymethylcyto-

sine (5hmC), the “sixth base”, are associated with anaplasia in human

brain tumors. Int J Cancer 131: 1577-1590

49. Szulwach KE, Li X, Li Y, Song C-X, Wu H, Dai Q, Irier H, Upadhyay

AK, Gearing M, Levey AI, Vasanthakumar A, Godley LA, Chang

Q, Cheng X, He C, Jin P (2011) 5-hmC-mediated epigenetic dynam-

ics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat Neurosci 14:

1607-1616

50. Dzitoyeva S, Chen H, Manev H (2012) Effect of aging on 5-hydroxy-

methylcytosine in brain mitochondria. Neurobiol Aging 33: 2881-2891

Role of 5-hydroxymethylcytosine and Tet proteins in

epigenetic regulation of gene expression

Sylwester Glowacki



, Janusz Blasiak

Department of Molecular Genetics, University of Lodz, 141/143 Pomorska St., 90-236 Lodz, Poland



e-mail [e-mail]

Key words: DNA methylation, 5-hydroksymethylcytosine, epigenetics, gene expression regulation

ABSTRACT

DNA methylation plays an important role in epigenetic regulation of human gene expression. Mechanism of active demethylation of the

human genome have been a matter of discussion for many years. Recently, a novel group of TET protein family enzymatically converting

5-methylcytosine into 5-hydroxymethylcytosine was discovered, playing a role in active DNA demethylation pathway. Results obtained in

subsequent studies pointed that 5-hydroxymethylcytosine was not only an intermediate in that pathway, but might also modify epigenetic

profile of the human genome.