ILOŚCIOWE OZNACZANIE CHLOROFILI I KAROTENOIDÓW

Naważkę biomasy roślinnej zhomogenizować w moździerzu z 2 ml metanolu. Homogenat po
3 krotnym przemyciu moździerza i pistla 1,5 ml metanolu odwirować w ciągu 10 min przy 1,5-2 tys. obr. / min. Następnie zlany supernatant uzupełnić do 8 ml metanolem.

Wartość ekstynkcji mierzyć wobec próby ślepej (metanol) przy dł fali 470 nm (dla karotenoidów), 653 nm i 666 nm (dla chlorofilu).

Stężenie barwników fotosyntetyzujących (ၭg/ml) obliczyć wg wzoru:

Chl a = 15.65 × A⁶⁶⁶ - 7.34 × A⁶⁵³

Chl b = 27.05 × A⁶⁵³ - 11.21 × A⁶⁶⁶

Carot = (1000 × A⁴⁷⁰ - 2.86 × Chl a - 129.2 × Chl b) / 221

Następnie zawartości przeliczyć na ၭg barwnika / 1 g, tj.:

Chl a = [(15.65 × A⁶⁶⁶ - 7.34 × A⁶⁵³) Ⴔ V] / M

Chl b = [(27.05 × A⁶⁵³ - 11.21 × A⁶⁶⁶) Ⴔ V] / M

Carot = [(1000 × A⁴⁷⁰ - 2.86 × Chl a - 129.2 × Chl b) / 221) Ⴔ V] / M

Chl a+b = Chl a + Chl b

Chl a/b = Chl a / Chl b

Carot - karotenoidy

Chl - chlorofil

A⁴⁷⁰, A⁶⁵³,A⁶⁶⁶ - wartości ekstynkcji dla długości fal: 470, 653 i 666 nm

V - całkowita objętość ekstraktu (w ml)

M - biomasa w g

OZNACZANIE WITAMINY C

1. Odważyć około 0,1 g witaminy C, rozpuścić w 25 ml wody dest., dodać 5 ml 5 % H₂SO₄ i 1 ml 2 % kleiku skrobiowego. Próbę miareczkować 0,1N roztworem jodu.

1 ml zużytego do miareczkowania roztworu jodu odpowiada 8,806 mg witaminy C

b) 5 ml soku z kwaszonej kapusty, ogórków lub innego materiału biologicznego po przesączeniu przez bibułę filtracyjną uzupełnić wodą destylowaną do 25 ml i miareczkować postępując zgodnie z punktem a.

REAKCJE BARWNE NIEKTÓRYCH WITAMIN I HORMONÓW

1. Reakcja Salkowskiego na cholesterol

Do 1 ml chloroformowego roztworu cholesterolu wlać ostrożnie po ściance nachylonej probówki
1 ml stężonego H₂SO₄. W obecności cholesterolu kwas fluoryzuje na zielono, a czerwone zabarwienie pojawia się w warstwie chloroformowej.

2. Reakcja na witaminę A i ၢ-karoten

1. Do oddzielnych probówek wlać po około 1 ml chloroformowego roztworu witaminy A i ၢ-karotenu. Do obudodać po 1 ml stężonego H₂SO_4. W obecności witaminy A i ၢ-karotenu powstaje niebieskawe zabarwienie.

2. Do 1 ml chloroformowego roztworu witaminy A dodać 1 ml odczynnika Carr-Price'a. W obecności witaminy A występuje niebieskawe zabarwienie przechodzące w fioletowo-czerwone.

3. Reakcje na witaminę D₃ i cholesterol

Do oddzielnych probówek wlać 1 ml chloroformowego roztworu witaminy D₃ i cholesterolu. Do obu dodać po 0,5 ml bezwodnika kwasu octowego i 1 kroplę stężonego H₂SO₄. W obecności cholesterolu i witaminy D₃ powstaje barwa czerwona przechodząca w niebiesko-zieloną.

4. Wykrywanie witaminy C

Do 1 ml wodnego roztworu witaminy C dodać 3 krople 0,1 % błękitu metylenowego. Dzięki właściwościom redukcyjnym witaminy C błękit odbarwia się. W wyniku wytrząsania barwa błękitu powraca dzięki utlenianiu tlenem z powietrza.

5. Wykrywanie witaminy B₁

Do 1 ml roztworu witaminy B₁ dodać 3 ml 2N NaOH i 2-3 krople 1 % roztworu K₄Fe(CN)₆, następnie wytrząsać próbę z alkoholem izobutylowym. W obecności witaminy B₁ warstwa alkoholowa wykazuje w ultrafiolecie niebieskawą fluorescencję.

6. Wykrywanie witaminy B₂

Do około 1 ml roztworu ryboflawiny dodać kilka kropli 1N NaOH, zmieszać i naświetlać 1 minutę lampą kwarcową w ciemni, następnie zakwasić 10 % CH₃COOH i zmieszać z równą objętością chloroformu. Warstwa chloroformowa fluoryzuje żółtozielono.

7. Wykrywanie auksyn (IAA)

Wykonać reakcję Pauly'ego jak przy aminokwasach:

Przygotowanie odczynnika dwuazowego:

Zmieszać w probówce równe ilości (po około 2 ml roztworu kwasu sulfanilowego i azotynu sodu). Zawartość probówki wytrząsać przez kilka minut chłodząc ją pod bieżącą wodą z kranu.

Do 0,5 ml odczynnika dwuazowego dodać 0,5 ml badanego roztworu auksyny. Składniki wymieszać i dodawać Na₂CO₃ do otrzymania czerwonego zabarwienia.

8. Wykrywanie insuliny

Do około 1 ml roztworu insuliny dodać 4-5 pastylek NaOH i 2 ml 2 % octanu ołowiawego. Całość ogrzewać 2-3 minuty. W obecności insuliny pojawia się brązowe zabarwienie płynu lub powstałego osadu.

---